[发明专利]用于使用内面朝外全细胞构型的自动多通道膜片钳记录的灌注系统和装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于执行膜片钳技术来研究生物膜的多通道系统。更 具体地，本发明涉及具有高通量和低体积要求的膜片钳系统。本发明更广 泛地涉及测试药物和其它化学制品的电生理效果。本发明还提供一种用于 高通量化学制品筛选的装置及其使用方法。

背景技术

通过因载体蛋白和离子通道作用引起的细胞膜电势的变化来控制许多 细胞过程。载体蛋白结合特定的溶质，以及通过构象变化来转移其跨过生 物细胞膜的脂双层，该构象变化顺序地在膜的一侧露出溶质结合位点，然 后在另一侧露出该位点。

与载体蛋白不同，离子通道蛋白是跨膜的蛋白，其在生物膜中形成孔 隙，该孔隙允许离子和其它分子从一侧通过到另一侧。有多种离子通道， 例如，“渗漏通道”、“电压门控通道”、“配体门控通道”和受到与蛋 白例如G蛋白的相互作用的调节的通道。

离子通道蛋白主要调节特定离子的透过性。例如，已鉴定钠(Na⁺)、 钾(K⁺)、氯(Cl^-)和钙(Ca²⁺)通道。离子通道主要负责产生细胞膜 电势，该细胞膜电势为细胞膜的相对侧的电荷差(B.Alberts等人，同上)。

广泛的多种载体蛋白和离子通道提供用于药物试剂的新靶的富裕聚 集。已知许多化学制品、化合物和配体影响载体蛋白和/或离子通道活性。

使用膜片钳分析技术可测量离子通道活性。Neher、Sakmann和 Steinback在“The Extracellular Patch Clamp，A Method For Resolving Currents Through Individual Open Channels In Biological Membranes，”Pflueger Arch.375；219-278，1978，中概述了使用微量吸管 电离析一片膜以及研究电压钳状况下该片膜中的通道蛋白的总构思。

膜片钳技术代表生物和医学中的主要发展。例如，该技术允许测量单 离子通道蛋白中的离子流，以及允许研究单离子通道对药物的响应。简要 地讲，在标准膜片钳技术中，相对细胞膜的表面按压细玻璃吸管(具有直 径一般约1μm的末端)。该吸管末端紧紧地与细胞密接，且离析膜的微片 中的少许离子通道蛋白。可电测量这些通道的活性(单通道记录)，或可 替换地，可破裂膜的片，这允许测量整个细胞膜的通道活性(全细胞记录)。

在单通道记录和全细胞记录中，通过跨膜施加“电压钳”，可进一步分 辨各通道子类型的活性。通过使用反馈回路，该“电压钳”施加跨膜的电压 梯度，这限制和控制整个通道活性，以及允许分辨离散的通道子类型。

这种实验中的时间分辨率和电压控制是惊人的，通常为毫秒甚至微秒 范围。然而，作为药物筛选中的一般方法，膜片钳技术的主要障碍为每日 可试验的化合物的有限数量。另外，由于更换样品化合物的缓慢速度以及 膜片钳吸管所需要的空间精确度，进一步限制了该标准技术。

限制膜片钳技术通量的主要因素为灌注系统，该灌注系统将溶解的试 验化合物导引到细胞和膜片。换言之，用一种溶液灌注(即浸)细胞，并 将试验化合物导入该溶液，从而可测量其对该细胞的影响。在常规膜片钳 装置中，将细胞置于大实验槽(0.2-2mL孔)，用生理盐水连续地灌注。 然后，通过将该槽的入口切换到与小数量的包含一种(多种)化学制品的 溶液瓶连接的阀，来施加该化学制品。然而，此技术具有一些缺点。首先， 一次可连接的不同化合物的数量受到供料瓶数量的限制。第二，试验样品 以及支持流体所需要的体积需要大量昂贵的化学制品。第三，改变细胞和 膜片周围的溶质组合物所需要的时间仍然是高的，且这是限速步骤。因此， 存在一些尝试来增加膜片钳记录的通量能力。

用于局部应用化合物来激活神经递质调节的通道的精密系统，如U毛 细管和其它系统的开发已降低了有效的应用时间。然而，这些快速应用系 统所交换的浴溶液的体积是相当大的。这样的大体积要求限制这些处理在 医药业的使用，这是因为试验不同浓度的数万种化学制品需要大量的时间 和高成本试剂。这些现有技术的系统进一步受到灌注U毛细管的进给系统 的不灵活性以及低容量的限制，该进给系统实际上与常规膜片钳试验所使 用的系统相同。