[发明专利]多谱系祖细胞

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2004年4月23日提交的美国临时专利申请序列号No.60/564,687的优先权。

技术领域

本发明涉及来自于人血的多谱系祖细胞(MLPC)，更具体涉及具有分化成多种组织谱系潜能的MLPC及其在再生治疗中的应用。

发明背景

已在多种来源中鉴定出能在清髓治疗后进行造血重建的祖细胞，其中包括骨髓、脐带血和胎盘血、以及用干细胞动员剂量的粒细胞集落刺激因子处理的受试者的外周血。这些细胞通常被称为造血干细胞(HSC)，因其表面存在细胞表面糖蛋白如CD34和CD133而被鉴定。HSC作为“骨髓移植”的一部分只占总细胞群的很小比例，被认为是这种治疗的救命部分，负责恢复经清髓剂量的化疗或放疗患者的血液形成能力。通过骨髓移植进行干细胞治疗已经成为许多难治的白血病和遗传性血液疾病的标准治疗方法。

最近的研究表明，在骨髓中存在一个较原始的细胞群，该群细胞能自我更新，并且能够分化成多种不同类型的组织，而不仅仅是血液细胞。这些多潜能细胞是在成人骨髓的CD34塑料粘附细胞群中作为次要成分而被发现的，曾被赋予各种名称，如间充质干细胞(MSC)(Pittenger等，Science 284：143-147(1999))或多潜能成年祖细胞(MAPC)(Furcht，L.T.等，美国专利公开20040107453 A1)。MSC细胞没有单一的特异性鉴别标记，但是研究发现有许多标记是阳性的，其中包括CD29、CD90、CD105和CD73，而另外一些标记是阴性的，其中包括CD14、CD3和CD4。不同的研究小组报道，MSC可分化成肌细胞、神经元、胰腺β细胞、肝细胞、骨细胞和结缔组织。另外一个研究小组(Wernet等，美国专利公开20020164794 A1)描述了一种具有多潜能的非限定性体细胞干细胞(USSC)，这种细胞来源于脐带血内的CD45^-/CD34^-细胞 群。

发明概述

本发明的基础在于从人胎儿血中鉴定稀有的未分化细胞群，该细胞群可自我更新，具有分化成分别代表三个胚层的细胞的潜能。这些胎儿血来源的细胞被称为多谱系祖细胞(MLPC)。如本文所描述，胎儿血MLPC与骨髓来源的MSC、HSC和USSC不同，其区别在于免疫表型特征、形态和不同的生长模式。本发明提供了从单个细胞培养单型克隆细胞系的方法。本发明还提供了深低温保存MLPC的方法(如，为了建立脐带血库)以及利用MLPC进行再生治疗的方法。

在一个方面，本发明的特征是人胎儿血(如脐带血)MLPC的纯化群，其中的MLPC是CD9和CD45阳性的。MLPC具有白细胞的形态。MLPC还可以是SSEA-4或CD34阳性的，以及CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干细胞因子、SSEA-3和CD13阳性的。MLPC可以是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61阴性的。MLPC在培养一段时间后可获得成纤维细胞样形态。MLPC在培养时还可以粘附到塑料表面。MLPC能够分化成所有三个胚层来源的细胞，其中包括，例如，具有骨细胞表型的细胞、具有脂肪细胞表型的细胞、具有神经干细胞表型的细胞、具有肌细胞表型的细胞、具有内皮细胞表型的细胞、具有肝细胞表型的细胞以及具有胰腺细胞表型的细胞。MLPC可包含外源核酸(如编码多肽的外源核酸)。

在另一方面，本发明的特征是人胎儿血(如脐带血)MLPC的纯化群，其中的MLPC是CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性的。MLPC具有成纤维细胞的形态。MLPC还可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性的，还可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子、SSEA-3和HLA-DR阴性的。MLPC在培养时可以粘附到塑料表面。MLPC能够分化成所有三个胚层来源的细胞，其中包括，例如，具有骨细胞表型的细胞、具有脂肪细胞表型的细胞、具有神经干细胞表型的细胞、具有肌细胞表型的细胞、具有内皮细胞表型的细胞、具有肝细胞表型的细胞以及具有胰腺细胞表型的细胞。MLPC可包含外源核酸(如编码多肽的外源核酸)。