[发明专利]烟草细胞色素p450基因的克隆

说明书

本发明涉及编码烟草植物细胞色素p450酶(以后称为p450和p450酶)的核酸序列，并涉及使用这些核酸序列来改变植物表型的方法。

发明背景

细胞色素p450能催化多种化学性质上不相似底物的酶促反应，其中包括内源和外源底物的氧化、过氧化和还原代谢。在植物中，p450参与包括苯丙酸(phenylpropanoid)、生物碱类、萜类、脂类、氰苷和葡糖异硫氰酸盐等植物产物的合成等生化途径(Chappel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.198，49：311-343)。细胞色素p450，也称为p450血红素-硫醇盐蛋白，它通常的作用是在称为含p450的单加氧酶系统的多组分电子传递链中作为终末氧化酶。它所催化的特定反应包括脱甲基化，羟基化，环氧化，N-氧化，磺氧化，N-、S-和O-脱烷基化、脱硫化、脱氨以及偶氮、硝基和N-氧基团的还原。

烟草植物p450酶的各种作用涉及影响苯丙酸、生物碱类、萜类、脂类、氰苷和葡糖异硫氰酸盐等多种植物代谢物，以及其它化学物质。近年来，已知一些p450酶在植物中可能影响到植物代谢物的组成。例如，人们一直希望通过育种改变所选脂肪酸的特性，来改善某些植物的味道和香气；然而，我们几乎不知道参与控制这些叶组分水平的机制。下调脂肪酸修饰有关的p450酶可能有助于所需脂肪酸的积累从而提供更优的叶子表型的品质。p450酶的功能以及它们对植物组成的广泛作用仍待揭示。例如，发现一类特定的p450酶能催化脂肪酸降解成挥发性的C6-和C9-醛和醇，这种醛和醇是构成水果和蔬菜“清新绿色”味道的主要物质。可改变其它新型靶向p450的水平，以通过修饰烟草叶片的脂质组成和相关降解代谢物来提高叶片组分的品质。烟草叶片中的一些这种组分受衰老的影响，而衰老会促进叶片品质特征的成熟。其它报道证明，p450酶有改变脂肪酸的作用，这些脂肪酸参与植物-病原体相互作用和对疾病的抗性。

在其它方面，已提出p450酶参与生物碱的生物合成。去甲烟碱是烟草(Nicotianatabaceum)中发现的次要生物碱。已假设该物质是由p450介导的烟碱脱甲基随后在N位酰化和硝基化产生的，从而可产生一系列N-酰基烟碱(N-acylnonicotine)和N-亚硝基去甲烟碱。由假定的p450脱甲基酶催化的N-脱甲基化被认为是烟草中去甲烟碱生物合成的主要来源。由于据信此酶是微粒体酶，因此至今未能成功纯化得到烟碱脱甲基酶，也未能分离到与其有关的基因。

此外，预计p450酶的活性受遗传控制同时受到环境因素的强烈影响，但还未证实。例如，当烟草长到成熟期时认为植物中烟碱的脱甲基化尤为增加。此外，预计脱甲基酶基因包含一个可转运的元件，该元件存在时可抑制RNA的翻译，但也未证实这一猜想。

在本发明之前，由于p450酶形式的多样性、它们的不同结构和功能使得对烟草p450酶的研究变得非常困难。此外，由于这些膜定位蛋白通常以低丰度存在且常对纯化不稳定，故而对p450酶的克隆至少部分受阻。因此，存在着对鉴定植物中p450酶和这些p450酶相关核酸序列的需要。特别是只报道了烟草中的少数细胞色素p450蛋白。这里本发明详细描述了一些细胞色素p450片段的发现，根据其序列相同性，这些片段相应于几组p450类型。

发明概述

本发明涉及植物p450酶。本发明也涉及烟草的植物p450酶。本发明还涉及植物中表达受乙烯和/或植物衰老所诱导的p450酶。本发明还涉及植物中具有酶活性(例如，可分类为加氧酶、脱甲基酶等)或其它活性的核酸序列，以及这些序列在降低或阻止这些酶表达或过表达中的应用。本发明还涉及在相对于具有较低去甲烟碱水平的植物，含有较高去甲烟碱水平的植物中发现的p450酶。