[发明专利]基因表达量比较分析法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量测定DNA片段混合物中各DNA片段含量的方法，具体说是一种用生物发光法同时测定各来源基因表达量的方法，可用于各来源基因表达量的比较分析。

背景技术

近年来随着分子生物学的进步，已测出几十种生物的全基因组顺序，人类基因组计划也即将完成^[1，2]。基因组计划的第一步是完成基因组的构造解析，第二步是进行基因功能解析，即了解基因转录产物mRNA的分布状态及mRNA的翻译产物蛋白质在细胞及脏器组织中的存在量、分布情况和作用。通过比较基因转录产物mRNA的表达量就可以推定未知基因的功能、解明基因间及蛋白质间的相互作用^[3]。因此基因表达量的分析已逐渐成为DNA分析的主要课题，在临床医学中，通过比较基因在不同个体(健康和疾病)(脑、肝或心脏)中的表达量，可以寻找和发现疾病基因，进而创造可治疗疾病的特效药，在疾病预防中因为肿瘤、糖尿病和肥胖病等是多基因疾病，用通常的方法很难做到及时诊断，但通过测定与疾病相关的基因在有关组织器官中的表达谱就早达到及可预见患病的危险性，以达预防的目的。此外在分子生物学研究中，通过基因表达量的分析，可以寻找功能基因，为生物品种的改良提供依据。到目前为止可用于基因表达量的方法有：Northern印迹法^[4]、RT-PCR法^[5]、测序法^[6，7]、微阵列法^[8，9，10](microarray)等。

Northern印迹法是经典的方法，主要用于数个或数十个基因的表达量分析。但该法测定极其繁锁，操作人员必须经过特殊训练，且需使用放射性物质，对人和环境有危害，测定效率不高。此外该法的灵敏度也很低，不能检出微小的基因表达量。

RT-PCR法是先将mRNA反转录成DNA后，用各基因的特异性引物与多聚腺嘌呤进行PCR扩增反应，然后用电泳分离各DNA片段，根据各样品的电泳条带的深浅判断有关基因表达情况和各基因表达量。该法灵敏度虽高，但重复性差，虽然内标可以定量，但定量性不好，因为PCR产物量与DNA底物量之间的线性关系差，测定结果不能很好地反映实际基因表达情况。

测序法是通过大规模测定cDNA的碱基序列而计算基因表达量的方法。主要有整体测序法(Body Mapping法)和基因表达系列分析法(Serial Analysis of Gene Expression，简称SAGE法)。该法结果准确可靠，前一种方法是用测序仪分别测定代表各基因的cDNA序列在样品中的出现频率，工作量很大，且需要许多昂贵的仪器；后一种方法，是经改进的测序法，即先用限制性内切酶把固定于微球(bead)表面的cDNA切成带有粘性切口的片段，然后，将与微球相连的DNA分成二等分，分别加入带有粘性切口的连接DNA A和B(记为Liker-A和Liker-B)，并使之连接，然后再用IIS内切酶(标记酶)切成带有9～12个标记碱基的片段，标记片段是用于鉴别基因的短核苷酸序列，因为IIS型内切酶能从特异性酶切位点开始切割成一定长度的标记碱基片段。将含有Linker-A和B的两部分混合，并用连接酶连接。加入引物A(Linker A中的部分)和引物B(Linker-B中的部分)进行PCR扩增，PCR产物中含有两个基因特异性标记。再用上述内切酶将PCR产物切割成含有4个碱基粘性切口的cDNA片段，连接后进行克隆，每个克隆中含有10～50个基因标记片段，每两个标记之间有一个含有四个碱基的短片段(内切酶的特异性序列)相隔。最后测定各克隆的序列，根据各标记在序列中的出现的频率计算各基因的表达量。该法虽然不需分别测定各cDNA的序列，但工作量仍然很大，且操作较为繁锁，需要使用价格昂贵的测序仪，普通实验室无法做到，非常规测定方法。

微阵列法是在固相表面上连接寡聚核苷酸片段(20～30个碱基)或cDNA，将生物样品中的mRNA提取转录成cDNA后与之杂交，同一块芯片可与两种不同来源的样品杂交，每一样品标记有不同荧光基团，通过芯片杂交点颜色的差异比较两种不同来源样品中mRNA的相对含量。该法的缺点是灵敏度低，定量性差，需要专门软件处理数据，且仪器价格昂贵。