[发明专利]并行比较微生物群落结构的分子生态监测方法

说明书

技术领域：本发明涉及的是一种微生物群落结构特征的分子生态监测方法，特别是一种并行比较微生物群落结构差异的分子生态监测方法，属于微生物生态学领域。

背景技术：微生物在许多国民经济生产部门中具有重要地位，例如生物医药(动物、人体保健)、生物农药(植物内生菌)、轻工食品和环境保护等领域都是利用微生物进行生产活动的，而且在多数情况下，这些生产部门的生产活动所依赖的是多种微生物组成的微生物群落的功能。长期以来，在利用微生物生态系统进行生产活动的许多行业部门，受所使用的微生物分离培养技术的限制，无法全面、客观认识系统中的群落成员，无法及时动态跟踪系统成员种群数量变化对系统功能的影响，生产效率不仅低，而且不稳定。而通过分析微生物群落的总基因组DNA的组成，可以比较客观地认识微生物群落的结构。可以用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列信息包括16S rDNA(核糖体小亚基基因)序列、已知功能基因的序列、重复序列以及随机基因组序列等。由于16SrDNA中包含了相应细菌种类的系统分类地位的信息，因此，以16S rDNA为对象可以比较准确地分析微生物群落的种群结构组成。经文献检索发现：Susan E.Pryde，Anyhony J.Richardson，Colin S.Stewart，and Harry J.Flint.1999.Molecular Analysis of the Microbial Diversity Present in the Colonic Wall，Colonic Lumen，and Cecal Lumen of a Pig.Appl.Environ.Microbiol.65：5372-5377，(对存在于猪的结肠壁、结肠内和盲肠内的微生物多样性的分子分析。应用与环境微生物学，65卷，5372-5377页。)一种常用的技术是构建基因文库。例如，根据16S rDNA在进化上的保守性特点设计具有不同专一性的通用引物，扩增环境中所有细菌或某一个类群细菌的16S rDNA，将扩增产物克隆到载体上构建成基因文库，通过分析一定数量的克隆子的序列以及它们的出现频率，可以在一定程度上了解环境样品中的主要细菌类群及其出现丰度等种群结构信息。这种方法需要进行克隆、测序等分子水平的工作，需要良好的实验条件和专用设备，耗费人力、财力和时间都较大，难以在医院、工厂等实际生产场所应用。另外，由于PCR扩增的偏好性，对生态系统样品中的种群结构的测度准确性也不特别高。又发现第二种常用的依赖16S rDNA的群落结构分析技术：Dicello F.，Bevivino A.，Chiarini L.，Fani R.，Paffetti D.，TabacchioniS.and Dalmastri C.1997.Biodiversity of a Burkholderia cepacia populationisolated from the maize rhizosphere at different plant growth stages.Appl.Environ.Microbiol.63：4485-4493.(从不同生长期的玉米根际分离得到的洋葱伯克霍尔德氏菌群的生物多样性研究。应用与环境微生物学，63卷，4485-4493页。)该技术是提取环境样品中的总DNA，用通用引物扩增16S rDNA，用各种限制性内切酶对扩增产物进行酶切分析，由于不同的群落内微生物种类组成不同，其酶切图谱也就不同，这样可以得到反映微生物群落结构组成特征的DNA凝胶电泳图谱，由于这种方法只能从分子量大小上对酶切产物进行分离，当比较两个不同微生物群落的结构差异时，图谱相似的群落，其种群组成不一定相同。目前基于16S rDNA扩增用的较多的还有通过温度梯度凝胶电泳或变性梯度凝胶电泳分析PCR扩增得到16S rDNA可变区(如V3区)序列的多样性，从而反映微生物区系的复杂性。但这种方法也只能对大小为500bp以下的序列进行有效分离，而且当微生物种类过多时，同一个条带可以包含多个种类的DNA信息，因此，不能做到在较高的分辨率下分析比较微生物群落结构的差异。

发明内容：本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种并行比较微生物群落结构差异的分子生态监测方法，所涉及用rep-PCR(重复序列聚合酶链式反应)扩增技术及混合探针分子杂交的方法，同时比较各种生态环境中微生物群落结构的差异及同一生态系统中微生物种群结构的时空动态变化，使本发明所涉及的rep-PCR及混合探针杂交的技术具有简便、快速、灵敏的特点，可同时分析比较多个微生物生态系统的结构差异及同一生态系统微生物种群结构的动态变化。