[发明专利]寄生型假丝酵母、热带假丝酵母和白隐球酵母检测鉴定方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地说是一种寄生型假丝酵母、热带假丝酵母和白隐球酵母快速检测鉴定方法。

技术背景：

寄生性假丝酵母和热带假丝酵母同属于半知菌类假丝酵母属，寄生性假丝酵母是人类重要病原菌，热带假丝酵母也是重要机会性病原菌，这两种酵母菌在普通和发酵饮食品和饲料中检出率很高(Déak，T.and Beauchat，1996；Samson R.A.，etal.，1992；Alvaro F.，Gloria S.，and Jack W.F.，2000)，白隐球酵母菌Cryptococcusalbidus和白假丝酵母菌Candida albidus都是(尤其是女性)皮肤组织感染的重要真菌类病原菌，由此两种病原菌引起的疾病临床诊断名称分别为白隐球酵母病Cryptococcosis和白假丝酵母病Candidiasis。显而易见，此三种酵母的快速检测、鉴定方法具有重要理论和实用意义。由于酵母菌传统分类以及本身的复杂性和多样性，对于发酵饮食品和饲料中寄生性假丝酵母和热带假丝酵母的准确检测往往需要花费大量时间。尽管目前已经可以应用基因扩增等先进方法对物种进行准确鉴定，但由于(1)酵母种类的多样性和复杂性，(2)基因扩增要求的病原菌的最低生物量(灵敏度)各不相同，(3)种间特异性引物设计的难度，(4)种内特异性PCR扩增产物序列确认的难度，使得该方法应用于快速鉴定、检测尚有一定距离。至少在目前还没有能够应用于一般生产和应用领域的PCR快速鉴定与检测方法。至于其他鉴定方法如化学分类、数值分类等等均需要做多次继代、精细化学分析难以达到一般生产和应用领域的快速要求。1975年Chaskes和Tyndall首先发现了重要病原菌Cryptococcus neoformans具有利用芳香性化合物(DOPA)通过体内代谢产生并分泌特异性有色产物(黑色素)的特性，和具有快速检测意义的特异性鉴定培养基。在过去几十年，不断有报道指出一些酵母能够利用芳香类化合物作为碳源通过体内代谢产生和分泌有色产物(Cain，1980；Middelhoven，1993；Chaskesand Phillips，1973；Chaskes和Tyndall，1975；1978；Carreira et al.，1998)，但真正运用这一原理作为一种分类指标加以研究和应用只是近几年的事情，1998年里斯本理工大学Virgilio B.Loureiro小组(Carreira and Loureiro，1998)利用这一原理建立了快速鉴定培养基，他们发现重要病原菌Cryptococcus能够特异性地利用氨基酚和二氨基苯产生和分泌有色产物，并首次建立了另外一种重要病原菌Yarrowialipolytica的快速鉴定培养基，发现：该种酵母能够以酪氨酸作为唯一碳源通过代谢产生褐色产物，而且这一特性具有种的特异性，通过优化培养基成分和培养条件，可以使这种特异性鉴定培养时间控制在24小时之内。此外，对于另外一种重要的病原菌Candida albicans，以特异性酶联免役反应为基础已经建立起有效的快速鉴定方法，并且已经应用于临床诊断(Hoppe J.E.and Frey P.，1999；Campbell C.K.etal.，1998)，显然，特异性生色培养基和特异性酶联免役反应是目前简单有效的病原菌快速检测鉴定手段，相比而言，特异性生色培养基比特异性酶联免疫反应具更廉价的商业优势。但是关于寄生型假丝酵母Candida parapsilosis和热带假丝酵母Candida tropicalis，目前尚无特异性生色鉴定培养基。

发明内容：

本发明提供一种专门用于寄生型假丝酵母、热带假丝酵母和白隐球酵母菌的特异性生色鉴定培养基，有效检测时间15-20小时。本发明检测培养基具备如下几个要素：一是待测菌株能够生长，二是产生特异性反应，三是反应指标明显易测，四是培养基中具有满足第二和第三条件的特殊成分。

一种用于检测鉴定寄生型假丝酵母、热带假丝酵母和白隐球酵母培养基，它除含有普通培养基所需的碳水化合物、生物素、维生素、琼脂，还含有对-氨基苯甲酸、螯合剂、生色反应促进剂以及三种碱性氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺和甘氨酸。

本发明所述的培养基，其碳水化合物可以是葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖之一，适宜浓度范围是0.01％到1.00％。其中葡萄糖、果糖和蔗糖是适宜碳源，优选葡萄糖。葡萄糖和果糖优选0.05％。

本发明所述的培养基中对-氨基苯甲酸的浓度范围是0.1％--1.0％，优选0.8％。