[发明专利]重组笼状蛋白质、其制造方法、贵金属－重组笼状蛋白质复合体、其制造方法、以及重组DNA

说明书

技术领域

本发明涉及使用基因重组技术制造的贵金属-重组去铁铁蛋白及其制造方法、以及它的相关技术。

背景技术

近年来，融合了生物技术和电子学的生物电子学的研究十分活跃，使用酶等的蛋白质的生物传感器等有的已经被实用化。

作为把这样的生物技术应用于其它领域的尝试的一种，有在具有保持金属化合物的功能的蛋白质即去铁铁蛋白中加入由金属或金属化合物构成的微粒，制造nm量级的均匀尺寸的微粒的研究。按微粒的用途，把各种金属或金属化合物等导入去铁铁蛋白中的研究在进行着。

这里，就去铁铁蛋白加以说明。去铁铁蛋白是生物界中广泛存在的蛋白质，担负着在生物体内调节必需微量元素即铁的量的任务。铁或铁化合物和去铁铁蛋白的复合体被称作铁蛋白。因为，如果在体内存在必要以上的铁，对生物体就有害，所以用该铁蛋白的形式在体内贮藏过剩的铁分。然后，铁蛋白按需要释放出铁离子，还原为去铁铁蛋白。

图1是表示铁蛋白(铁-去铁铁蛋白复合体)的结构的模式图。如同一图所示，铁蛋白是通过非共价键把24个由一条多肽链形成的单体亚单元集合在一起，形成分子量约46万的球状蛋白质，其直径约为12nm，与通常的蛋白质相比，表现出高的热稳定性和高的pH稳定性。在该球状蛋白质(外壳2)的中心有直径约为6nm的空洞状保持部4，外部和保持部4通过通道3连在一起。例如，当在铁蛋白中加入二价的铁离子时，铁离子从通道3进入，在一部分的亚单元内具有的被称作ferrooxidasecenter(铁氧化活性中心)的场所被氧化后，到达保持部4，在保持部4的内表面的负电荷领域被浓缩。然后，铁原子3000～4000个集合在一起，以铁氢化物(5Fe₂O₃·9H₂O)结晶的形式保持在保持部4内。

另外，在本说明书中，把保持在保持部的含有金属原子的微粒称作“核”。这里，如图1所示的核1的直径与保持部4几乎相等，约为6nm。

另外，把用比较简单的化学操作去掉该核1，把去掉了核1后只剩下外壳2的粒子称作去铁铁蛋白。使用该去铁铁蛋白能制作保持着铁以外的金属或金属化合物的去铁铁蛋白微粒复合体。

到现在为止，有报告显示已经进行了把锰(P.Mackle，1993，J.Amer.Chem.Soc.115，8471-8472；F.C.Meldrum，1995，J.Inorg.Biochem.58，59-68)、铀(J.F.Hainfeld，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，11064-11068)、铍(D.J.Price，1983，J.Biol.Chem.258，10873-10880)、铝(J.Fleming，1987，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，84，7866-7870)、锌(D.Price andJ.G.Joshii，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1982，79，3116-3119)、钴(T.Douglas and V.T.Stark，Inorg.Chem.，39，2000，1828-1830)等金属或金属化合物导入到去铁铁蛋白。由这些金属或金属化合物构成的核1的直径也与去铁铁蛋白的保持部4几乎相等，约为6nm。

在自然界中，含有铁原子的核1在铁蛋白内的形成过程大致如下。

在连接了铁蛋白粒子的外部和内部的通道3(参照图1)的表面上，在pH7-8的条件下，露出带负电荷的氨基酸，带正电荷的Fe²⁺离子由于静电的相互作用被吸入通道3。在一个去铁铁蛋白中存在八个该通道3。

在去铁铁蛋白的保持部4的内表面上，与通道3的内表面同样，以pH7-8，露出很多带负电荷的氨基酸即谷氨酸残基，从通道3吸入的Fe²⁺离子在铁氧化活性中心被氧化，再被导入到内部的保持部4。然后，由于静电的相互作用，铁离子被浓缩，形成铁氢化物(5Fe₂O₃·9H₂O)结晶的核。

然后，依次吸入的铁离子附着在该结晶的核上，由氧化铁构成的核成长，在保持部4内形成直径6nm的核1。以上是铁离子的吸入和由氧化铁构成的核的形成的大致过程。

下面，就用于把铁导入到去铁铁蛋白的操作加以说明。