[发明专利]蝎抗心律失常肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蝎抗心律失常肽，以及产生蝎抗心律失常肽的方法。具体地说，本发明涉及一种高效生物活性的蝎抗心律失常肽，采用基因工程和生物化学手段产生蝎抗心律失常肽的方法，产生的蝎抗心律失常肽在制备抗心律失常药中的应用。

背景技术

东亚钳蝎是中国分布最广的一类蝎种，因其蝎毒有复杂的成分和性质而产生多种生理、药理活性，成为蝎类药材的主要来源，对抗肿瘤、治疗风湿、抗癫痫以及心血管疾病有重要冶疗作用。但是由于蝎毒成分复杂，许多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低，这些无疑都限制了蝎毒的治疗作用。从蝎毒中找出并分离或者通过基因工程的方法生产有效的成分则变得十分必要。沈阳药科大学以及上海生化所都从蝎毒中分离得到了抗癫痫肽，然而，至今尚未从蝎毒中找到一种能治疗心脏病的成分。最近，中国专利00112016.6以及张景海等(Zhang JH，Hua ZC，Xu Z，Zheng WJ，Zhu DX，Prep BiochemBiotechnol 2001 Feb 31：49-57)发现了东亚钳蝎抗神经兴奋肽的基因并采用pET28a载体在大肠杆菌BL21中表达生产蝎抗神经兴奋肽，然而由于其设计的PCR引物中不含有将表达载体中的组氨酸与抗神经兴奋肽分割开的蛋白酶酶切位点，使得表达产生的神经兴奋肽必然是一个含有多个额外组氨酸(His)的融合重组蛋白。这些额外的组氨酸会影响重组肽的结构以至它相关的功能。据报道，这种重组肽仅能使小鼠神经兴奋发作的潜伏时间延长20％，而且产量不高，且大部分形成包含体，不可溶。即采用张景海描述的方法所表达的产物抗神经兴奋作用的活性不高，而且应用有限。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种蝎抗心律失常肽，具有高效生物活性

本发明的另一个目的在于提供一种生产高效生物活性蝎抗心律失常肽的方法，采用本发明的方法生产的蝎抗心律失常肽不仅具有抗神经兴奋的作用，而且有明显的抗心律失常活性。

本发明的还有一个目的在于提供一种蝎抗心律失常肽在抗心律失常药中的应用。

本发明的再一个目的在于提供一种用基因工程方法产生的蝎抗心律失常肽在抗心律失常药中的应用。

一种蝎抗心律失常肽，其特征是，该活性肽的氨基酸序列如下：

DGYIRGSNGCLWGNEGCNKECKGFGYCWTWGLACWCEGLTWKSESNTCG。

本发明提供的蝎抗心律失常肽与从蝎抗心律失常肽cDNA推导的成熟氨基酸序列一至，并且不含有影响生物活性的额外组氨酸片段和其它氨基酸序列。蝎抗心律失常肽呈可溶状态，不形成包含体，圆二色谱显示其二级结构与其它天然蝎毒多肽相似，即这种肽能真实反应蝎抗心律失常基因的功能。本发明提供的重组肽不仅有抗癫痫的作用而且有明显的抗心律失常作用。

一种生产蝎抗心律失常肽的方法，包括设计PCR引物，用PCR从东亚钳蝎蝎毒cDNA库中扩增蝎抗心律失常肽基因片段，并通过表达载体转化到大肠杆菌中表达。其特征是：设计的PCR引物含小肠激酶酶切位点，用PCR扩增的蝎抗心律失常肽基因片段克隆到pGEX-5x-1表达载体中，转化到大肠杆菌BL21中获得重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM)，经IPTG诱导后，用小肠激酶酶切表达的融合蛋白，再经过脱盐而获得可溶的蝎抗心律失常肽。

从构建的蝎毒腺cDNA文库(Xian-chun Zeng，Wen-Xin Li，Shun-Yi Zhu，Fang Peng，Toxicon 2000 38：893-899)中筛选到与抗神经兴奋肽基因相似的cDNA序列，在推导的氨基酸序列中，其信号肽区有三个氨基酸的差异，其它区域相同，称此cDNA序列为蝎抗心律失常肽基因：

上述为蝎抗心律失常肽的cDNA序列，下划线的部分为信号肽区，阴影部分是蝎毒多肽在体内加工成熟的过程中按照贯例会被切除的部分，加点的区域为引物设计区，加黑字母表示与蝎抗神经兴奋肽不同的氨基酸。根据蝎抗心律失常肽基因序列设计上游、下游引物，将蝎抗心律失常肽基因扦入表达载体pGEX-5x-1质粒，构建重组表达载体，转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM)。经IPTG诱导，表达谷胱甘肽转移酶-蝎抗心律失常肽融合蛋白，经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后用小肠激酶酶切，酶切产物经过SephadexG-50纯化和脱盐，得到可溶的且有活性的重组蝎抗心律失常肽。