[发明专利]新型肿瘤凋亡素2配体基因、其表达的肿瘤凋亡素及其制法

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物工程技术领域，是从中国人外周血单个核细胞中获得的一种新型的肿瘤凋亡素2配体基因，并利用该基因制备人可溶性肿瘤凋亡蛋白——肿瘤凋亡素的方法。

背景技术

1995年，国外报道从人表达标签序列文库(expressed sequence tag，EST)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白的基因(GenBank No.：U57059；U37518；NM003810；XM 045049)，该基因编码的蛋白质称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称肿瘤凋亡素2配体(apoptotin-2 ligand，简称Apo-2L)，是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员之一，其可有效地诱导肿瘤和转化细胞凋亡，而对正常细胞无影响。人Apo-2L基因的编码序列有843个核苷酸，核苷酸序列见GenBank No.：U57059；U37518；NM 003810；XM 045049，编码的蛋白质Apo-2L由281个氨基酸组成。业已证明Apo-2L是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第114位开始的胞外区可形成游离的可溶性肿瘤凋亡素蛋白Apo-2L₁₁₄，也称TRAIL₁₁₄，同样具有肿瘤凋亡作用。目前国内外对Apo-2L₁₁₄的制备都使用Apo-2L基因。然而由于进行原核重组表达Apo-2L₁₁₄时，所使用的是商品化表达载体，如pET(Novagen公司)或pEQ(Qiagen公司)等，重组蛋白呈包涵体，其必须经复性才有可能表现生物学活性，而复性过程是比较困难和不稳定的，且不是所有的包涵体都可复性的。

发明内容

本发明从中国人外周血单个核细胞中获得了一种新型肿瘤凋亡素2配体基因，称其为Apo-2L I基因。Apo-2L I基因的编码序列由801个核苷酸组成，与已有的Apo-2L基因相比，除了少了位于后者编码区5’端第271～313位的42个核苷酸外，其余部分基本相同，即使个别核苷酸不同，也不改变编码的相应氨基酸，Apo-2L I基因的核苷酸序列见表1。由Apo-2L I基因编码的蛋白相应也少了14个氨基酸，由267个氨基酸组成，氨基酸序列见表2。其与Apo-2L一样具有使肿瘤细胞凋亡的作用。

本发明用Apo-2L I基因来制备人可溶性肿瘤凋亡素。以Apo-2L I基因为模板，通过PCR扩增，从编码序列5’端第297-801位核苷酸得到人可溶性肿瘤凋亡素基因，其编码的氨基酸相当于Apo-2L I蛋白N-端第100～267位氨基酸，故称其为Apo-2L I₁₀₀基因，其与Apo-2L₁₁₄基因一样，由504个核苷酸组成。其编码的蛋白与Apo-2L I₁₁₄相同，也由168个氨基酸组成，称之为Apo-2L I₁₀₀或肿瘤凋亡素。

制备Apo-2L I₁₀₀所使用的表达载体为pBV220。pBV220由中国预防医学科学院病毒研究所提供，该载体是温控型的原核表达载体，其表达量较高。本发明通过合成寡聚核苷酸，置换原pBV220载体Bg1II与Xmn I之间的序列，所构建的表达载体命名为pBV-Apo-2L I₁₀₀，该质粒转化大肠杆菌，所得的工程菌能直接表达具有生物学活性的Apo-2L I₁₀₀。使Apo-2L I₁₀₀表达量占工程菌总蛋白的40％以上，占破碎后工程菌上清总蛋白的10％以上，大大提高了肿瘤凋亡素Apo-2L I₁₀₀的产量和质量，且制备方法简便。

本发明Apo-2L I基因的克隆，Apo-2L I₁₀₀的制备，具体包括如下步骤：

一、构建cDNA文库，制备Apo-2L I基因

1.制备人外周血单个核细胞总RNA

(1)按常规方法从中国人外周血中分离淋巴细胞，进而用贴壁法获得单个核细胞；

(2)用细菌内毒素激活单个核细胞以刺激细胞提高RNA的丰度，再用RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA。

2.筛选Apo-2L I基因

(1)构建cDNA文库