[发明专利]耐高温磷酸庚糖异构酶基因及其编码的多肽和制备方法

说明书

                          技术领域

本发明涉及遗传工程领域，具体地，涉及一种耐高温磷酸庚糖异构酶基因及其编码的多肽及制备该多肽的方法。

                          背景技术

耐高温磷酸庚糖异构酶(phosphoheptose isomerase)的编码基因为gmhA，该酶的作用是催化ADP-L-甘油-D-甘露型庚糖(ADP-L-glycero-D-mannoheptose)的生物合成过程中的第一步反应。而且在肠细菌中，该耐高温磷酸庚糖异构酶是保守的，而这些肠细菌的脂多糖内部核心都含有甘油甘露庚糖，这表明该耐高温磷酸庚糖异构酶是脂多糖内部核心的保守性生物合成途径的必要成份。

耐高温编码磷酸异构酶含有501个氨基酸，其推测分子量为23805道尔顿。L-甘油-D-甘露型庚糖(L-glycero-D-manno heptose)是某些肠道和非肠道革兰氏阴性细菌的脂多糖核心区的典型组分。

脂多糖(lipopolysaccharide)(缩写为LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的整合性组分，由脂质A连接于一核心寡糖。某些微生物中脂多糖含有一个O-特异性表面多糖，它又与核心的末端残基连接。核心寡糖含一由3-脱氧-D甘露型辛酮糖酸及L-甘油-D-甘露型庚糖组成的内部结构域还含一由己糖和N-乙酰氨基葡糖组成的外结构域。通过与膜其他组分相互作用而维持外膜结构的完整性并为外来的有害化合物及一些抗菌素的进入提供物理屏障。大肠杆菌和酵母菌在脂多糖内部核心有缺陷的突变体其膜孔蛋白质急剧降低，并且不能在含有去污剂、胆盐或抗生素的培养基中生长。

因此，磷酸庚糖异构酶酶在工业生产、农业生产，及医药业具有重要的应用前景。

本发明涉及的腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tangcongensis)，是生活在我国云南省腾冲县的热泉中的一种微生物，是一种嗜热的真细菌(eubacteria)，最适生长温度为75摄氏度，厌氧生长，革兰氏染色反应呈阳性。它是由中国科学院微生物所首先发现并进行了分类学上的分析。菌种保存在中国微生物保存中心MB4^T(Chinese collection of microorganisms AS 1.2430^T＝JCM 11007^T)。该嗜热厌氧菌是我国特有的一个物种，其体内所具有的耐高温磷酸庚糖异构酶也具有自己特有的结构。

                          发明内容

本发明涉及嗜热厌氧菌的磷酸庚糖异构酶基因的分离及表达。以腾冲嗜热厌氧菌全基因组测序与分析为基础，克隆分离了耐高温磷酸庚糖异构酶基因。运用该基因生产耐高温磷酸庚糖异构酶的转基因微生物或动植物，并回收获得该基因编码的酶。另外，本发明还提供了具有耐高温磷酸庚糖异构酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同体。同时，本发明还提供了制备，分离，纯化具有耐高温磷酸庚糖异构酶活性的多肽的方法。

本发明的目的之一是提供一种分离的，编码具有耐高温磷酸庚糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列。

本发明的目的之二是提供一种分离的，具有耐高温磷酸庚糖异构酶活性多肽。

本发明的目的之三是提供了含有编码耐高温磷酸庚糖异构酶的DNA的重组载体、含有前述重组载体的宿主细胞，以及生产该蛋白的方法。

本发明一方面提供了一种编码具有耐高温磷酸庚糖异构酶活性的多肽的核苷酸序列。该核苷酸序列能编码具有序列表SEQ ID NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式，该修饰形式功能上相当或与磷酸庚糖异构酶相关。核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突变形式，突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。

本发明另一方面提供一种耐高温磷酸庚糖异构酶活性的多肽。该多肽具有序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

本发明提供的制备耐高温磷酸庚糖异构酶的方法，它包括以下步骤：

1)分离出核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示的编码耐高温磷酸庚糖异构酶的基因：

2)构建含有如步骤1)所述的基因的核苷酸序列的表达载体；

3)将步骤2)中表达载体转入宿主细胞，形成能生产耐高温磷酸庚糖异构酶的重组细胞；

4)培养步骤3)中的重组细胞；

5)分离、纯化得到耐高温磷酸庚糖异构酶。