[发明专利]肽载体

说明书

                          背景技术

本发明涉及一种可以使得基因转移而不具有细胞特异性且不会诱发宿主免疫反应的肽载体。

已知主要将病毒载体通过使用其细胞内渗能力而用于将基因导入活体。这些病毒载体例如包括腺病毒、疱疹病毒、反转录病毒等。

腺病毒是一种非包膜的双链DNA病毒且导致人体内轻微的上呼吸道感染、角膜结膜炎、肠胃炎等。腺病毒基因组约有36kb且易于通过使用常规的重组DNA技术控制。通过使腺病毒的尾丝染色纽(fiberknob)蛋白与细胞表面上的柯萨奇和腺病毒(coxackie & Adenovirus)受体(CAR)结合来启动病毒的细胞内渗。随后借助于细胞表面上整联蛋白(αvβ 3、αvβ 5)与壳体五邻体基质的相互作用、通过披网格蛋白的胞吞将病毒体导入细胞。然后在内体的低pH条件下引发病毒体衣壳蛋白的构象变化，从而使得病毒体衣壳蛋白释放到胞质中。在所述的蛋白质释放后，衣壳蛋白易位至核，其中进行其复制和转录。可以将基因的转录分成两种不同类型，即在复制前表达的早期基因(E)和在复制后表达的晚期基因(L)。用于基因疗法的腺病毒缺乏E1基因区而产生不完全的复制，由此将其用于含有插入其中的其它DNAs的形式中。因此，可以培养重组腺病毒载体以便使诸如HEK293这样可以连续表达E1基因的细胞系增加。

带有包膜的反转录病毒是一种单链RNA病毒，它带有约7～10kb的二倍体基因组且包括分别称作gag、pro、pol和env的4个基因组。基因组中的每一个编码结构衣壳蛋白、病毒蛋白酶、整合酶、逆转录酶、包膜和糖蛋白等。反转录病毒带有称作长末端重复序列(LTR)的包装信号(ψ)和顺式作用序列。开始通过使包膜糖蛋白与其细胞表面受体结合且随后通过使病毒包膜与细胞膜融合、由此将壳体核摄入所述细胞可以对细胞进行反转录病毒感染。一旦衣壳进入胞质，则壳体内侧的逆转录酶产生双链原病毒基因组，该基因组与整合酶形成一种复合体并移至核膜。当核膜在有丝分裂过程中消失时，所述的复合体开始进入核。导入核的原病毒基因组借助于整合酶插入宿主的染色体以便通过使用宿主转录仪表达病毒基因组。重组反转录病毒载体不表达任何病毒基因，这使得它与上述腺病毒载体区别开来，此时其全部基因被替代成除LTRs和ψ序列外的标记或治疗基因。为了培养这类重组反转录病毒，应以反式形式表达gag、pol和env的病毒基因，可以通过使用以稳定方式表达这些基因的细胞系来达到这一目的。

腺结合病毒属于细小病毒科且是一种带有短单链DNA基因组的简单病毒。腺结合病毒由两个属于rep(控制)和cap(结构)的可读框(ORF)和两个末端反向重复序列(ITRs)组成。末端反向重复序列是包壳和整合入宿主基因组所需的唯一部分，从而将其稳定地整合入第19条人染色体。然而，该病毒不具有自我生长能力，由此它仅能够在有诸如腺病毒或疱疹病毒等这样的辅助病毒存在的情况下生长。通过与带有在末端反向重复序列之间插入的转录单位的质粒和含有rep和cap可读框的质粒一起共转染来形成重组腺结合病毒，而此时需要用诸如腺病毒这样的辅助病毒进行轻感染。在对重组腺结合病毒进行纯化步骤后，可以将其用于基因疗法的应用。

单纯疱疹1型病毒是一种带有包膜的双链DNA病毒。它编码80或80个以上来自其152kb基因组的基因且在其包膜糖蛋白(gB、gC)与从全部类型的细胞膜中发现的胞外磷酸乙酰肝素结合时具有显著宽范围的宿主。当这种病毒进入宿主细胞时，宿主的病毒包膜糖蛋白gD和成纤维细胞生长因子(FGF)受体是必不可少的。可以将单纯疱疹病毒载体分成两种类型，即重组单纯疱疹病毒载体和扩增子载体，其中重组单纯疱疹病毒载体带有直接插入其基因组的转录单位；而扩增子载体是一种用辅助病毒感染的质粒，其中所述的质粒含有转录单位、复制起点和包装信号。使扩增子载体进行滚环复制，从而产生在包装过程中带有插入的多拷贝基因的单纯疱疹病毒。

上述那些病毒载体具有其自身的优点和缺点。对上述这些病毒载体来说常见的问题包括对可以被它们所感染的细胞范围有限制、即在可以接受它们的细胞存在限制，并且会通过宿主免疫反应产生失活。当这些类型的载体具有这类局限时，它们不适用于所有类型的细胞。

因此，已经作了许多努力来克服这些难题且这些努力中的大部分涉及使用细胞类型特异性启动子改变病毒感染特异性细胞的天然向性或仅在特异性细胞中表达转基因。然而，在任何这些努力中均没有令人满意的结果。

                          发明概述

本发明的一个目的是提供一种不具有细胞特异性的肽载体。