[发明专利]获得用于构筑生物芯片微阵列的固相支持体的表面活化的方法

说明书

发明领域

[0001]本发明涉及一种获得固相支持体表面活化的方法，该方法通过所说固相支持体表面的官能化使分子(捕获核苷酸序列、捕获抗体、受体等)结合以改善微阵列的构筑。

现有技术状况

[0002]微阵列是同时探测存在于样品，优选的是像核苷酸序列、 配体、抗体等生物分子中的多种不同靶分子的强有力工具。对于DNA生物芯片，存在于阵列上的分子的结合性能主要取决于捕获核苷酸序列的数量、序列和长度以及它们编址(addressed)到支持体上的方式。DNA生物芯片技术运用固定在固相支持体上的DNA分子的微观阵列。生物芯片微阵列申请众多，并用于生物医学分析，例如基因表达分析、多态性或突变检测、分子诊断、DNA测序以及发现基因(Ramsay等人，Nature Biotechnology 16，p.40(1998))。

[0003]可以通过许多方法制备这样的DNA微阵列。使用组合化学原理(Pease等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，p.5022(1994))，可以在玻璃表面上原地合成DNA。此方法制造的DNA微阵列由10-25个碱基的低聚核苷酸基团组成，而例如在通过多聚酶链式反应(PCR)扩增之后，用机器人微沉积制备的微阵列可以为从小低聚核苷酸到0.5-2kb核苷酸序列的任何长度(Zammatteo等人，Anal.Biochem.253，p.180(1997))。机械微量点样使用被动(针头)或主动(墨喷嘴)设备将少量DNA输送到已知区域上。

[0004]对于DNA生物芯片，玻璃是流行的基质，主要是由于其荧光性低、透明性、成本低以及抗高温和多种化学试剂的能力(Cheung等人，Nature Genetics supplement 21，p.15(1999))。它也比多孔膜和凝胶基垫有许多实用的优点。正如液体不能渗入支持体表面，靶核苷酸序列直接进入相应的捕获核苷酸序列而不扩散入气孔中(Southern等人，Nature Genetics supplements 21，p.5(1999))。目前，实验室中使用载玻片是因为它们易于操纵并适合于自动读出器。

[0005]已经有人建议，(通过加入聚赖氨酸(Schena等人，科学270，p.467(1995))或通过疏水性涂层(Allemand等人，Biophys.J.73，p.2064(1997))改变玻璃表面性质以获得DNA核苷酸序列的直接结合。然而，在这些情况下，在高盐或高温条件下，DNA链容易从表面上脱离。因此，优选的是共价键法。通过紫外辐射在DNA酸顺序中胸苷残留物和附在官能化载玻片上带正电的胺基之间形成共价键，可以使DNA交联(Duggan等人，Nature Genetics supplements 21，p.10(1999))。然而，DNA分子附着点的位置和数目不好限定，所以对杂交有用的长度和序列随固定条件的改变而变化。另一种方法是通过其末端的一端固定DNA分子。因此，羧化DNA(Joos等人，Anal.Biochem.247，p.96(1997))或磷酸化DNA(Rasmussen等人，Anal.Biochem.198，p.138(1991))可以偶合到胺化支持体上以及倒易的位置上(Ghosh等人，Nucleic Acids Res.15，p.5353(1987))。其它方法基是将胺基末端低聚核苷酸结合到异硫氰酸酯活化的玻璃(Guo等人，Nucleic Acids Res.22，p.5456(1999))，醛活化玻璃(Schena等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，p.10614(1996))或用环氧化物改性的表面(Lamture等人，Nucleic AcidsRes.22，p.2121(1994))上。硫醇改性或二硫化物改性的低聚核苷酸也通过异双功能(heterobifunctional)交联剂嫁接到胺基硅烷上(Chrisey等人，Nucleic Acids Res.24，p.3031(1996))或3-巯丙基硅烷上(Rogers等人，Anal.Biochem.266，p.23(1999))。然而，在这些情况下，结合在高温下是不稳定的。最近，对于在可以附着DNA的玻璃上粘结分子的结构，已经有人提出更精细的化学过程(Beier等人，Nucleic Acids Res.27，p.1970(1999))。