[发明专利]包括白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原的四价联合疫苗及其制备方法

说明书

                        发明领域

本发明涉及一种包括白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳苗和乙型肝炎表面抗原的四价联合疫苗(以下称DTwPH联合疫苗)及其制备方法。

在世界卫生组织(WHO)的扩大免疫计划(EPI)中，推荐同时接种抗白喉、破伤风和百日咳的DTP联合疫苗作为几乎全世界国家婴儿使用的基本疫苗。在东南亚、中亚、非洲和南美东南亚最为普遍的乙肝感染，被认为是肝癌的一种潜在起因。然而，乙肝感染也可通过免疫来预防，因此WHO积极开展全世界乙肝疫苗接种活动。

最近，为了消除单独接种具有不同接种程序的DTP联合疫苗和乙肝疫苗的麻烦，以及将这些疫苗以降低的价格供应给不发达国家以增加其疫苗接种率，现已有商业化的包括白喉类毒素、破伤风类毒素、无细胞百日咳和HBsAg的联合疫苗产品(DTaPH)(欧洲专利公布号0642355B1，6月15日，1998；韩国专利公布号1992-0009729，绿十字公司)。

                 发明背景

与DTwPH联合疫苗的制备相关进行了积极研究，以解决这种联合疫苗药物制备中遇到的问题，在保留HBsAg免疫原性的同时防止毒性的增加。

在联合疫苗药物制备中发生的问题包括单个疫苗溶液的聚集和疫苗对玻璃贮藏瓶的粘附。这里，术语“聚集”指形成轻微摇动不能使其悬浮的固体物质，术语“粘附”指DTwPH联合疫苗颗粒结合到贮藏玻璃瓶壁上，结合很牢固，轻微摇动不能使其分离。DTwPH联合疫苗中的聚集是由各疫苗吸附溶液和百日咳杆菌之间尤其是用作吸附剂的氢氧化铝凝胶和百日咳杆菌之间的静电引力引起的。这种粘附由DTwPH联合疫苗颗粒和玻璃瓶壁之间长期的反应引起。因为DTwPH联合疫苗长期贮存，聚集和粘附现象使联合疫苗产品的稳定性严重降低。

DTwPH联合疫苗由于吸附剂和蛋白过量而具有毒性增加的问题。此外，因为HBsAg与其它抗原相容性差，与同时接种两种单独的疫苗DPT联合疫苗和乙肝疫苗相比，其免疫原性降低(WHO总部，白喉-破伤风-百日咳-乙肝四价疫苗非正式会议，1992)。

因此，本发明目的是有效防止上述“聚集”和“粘附”现象，也提供一种新的DTwPH联合疫苗及其制备方法，可保留HBsAg的免疫原性，使其与同时接种单独的三价DTP联合疫苗和单一抗原乙肝疫苗具有相同的几何平均抗体滴度(ab GMT)和有效抗体生成率。

                  发明详述

本发明提供了一种新的四价DTwPH联合疫苗，包括白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳和HBsAg，其中白喉类毒素和破伤风类毒素吸附于磷酸铝凝胶(AlPO₄)，HBsAg吸附于氢氧化铝凝胶(Al(OH)₃)。

本发明也提供了DTwPH联合疫苗的制备方法，包括(a)在制备最终的DTwPH联合疫苗组合物之前，调节吸附白喉类毒素的磷酸铝凝胶溶液、吸附破伤风类毒素的磷酸铝凝胶溶液、吸附HBsAg的氢氧化铝凝胶溶液和百日咳贮备溶液的pH范围为6.5-7.5；(b)将调整了pH的白喉类毒素和破伤风类毒素吸附溶液混合；和(c)将在步骤(b)中获得的混合物与调整了pH的HBsAg吸附溶液和灭活百日咳贮备液混合。

本发明也提供了联合疫苗贮藏方法，包括将明胶加入普通联合疫苗或上述DTwPH联合疫苗，或使用硅涂层的玻璃瓶作为联合疫苗的贮藏瓶。优选明胶的浓度范围为0.1-0.7w/v％。

以下将更详细地描述本发明的结构和作用。

本发明使用的白喉类毒素贮备液通过培养白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)Park Willium株制备。将产生的培养上清过滤、沉淀及福尔马林去毒后纯化，获得适当的白喉类毒素贮备液。可使用上述以外的菌株和方法来获得适当的白喉类毒素贮备液。

破伤风类毒素贮备液通过培养破伤风杆菌(Clostridium tetani)Harvard株制备。将产生的培养上清液过滤、沉淀及福尔马林去毒后纯化，获得适当的白喉类毒素贮备液。可使用上述以外的菌株和方法来获得适当的白喉类毒素贮备液。

百日咳贮备液通过培养百日咳杆菌(Bordetella pertussis)制备。将产生的培养液离心。获得的百日咳沉淀悬浮在盐水中并通过处理灭活，获得适当的灭活百日咳贮备液。可使用上述以外的菌株和方法来获得适当的百日咳贮备液。