[发明专利]丝状真菌中DNA表达文库的高通量筛选

权利要求书

1.一种表达由一组DNA载体库编码的多种蛋白质的方法，其中载体库包括多种不同的载体，每种载体都包含一种不同的编码蛋白质的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接于一种表达调控区和任选连接一种分泌信号编码序列，所述方法包括以下步骤：

(a)提供一种具有悬浮生长表型特征的丝状真菌株，并且具有在悬浮条件下产生可转移性复制单元的特征；

(b)使用上述DNA载体库稳定转化上述丝状真菌株，使每个单一菌株都至少含有一种编码外源蛋白的核酸序列；

(c)将转化的丝状真菌突变株在有利于形成可转移性复制单元的悬浮培养条件下培养；

(d)将各种不同的可转移性复制单元相互分离；和

(e)在有利于外源蛋白编码核酸序列表达外源蛋白的条件下，培养成单个可转移性复制单元的单克隆培养物或单克隆。

2.一种在由DNA载体库编码的多种蛋白质中筛选具有所需活性或特性蛋白质的方法，包括以下步骤：

(a)按照权利要求1的方法在单克隆丝状真菌培养物或单克隆丝状真菌克隆中表达多种蛋白质；和

(b)筛选单个克隆培养物或克隆菌落的所需活性或特性。

3.一种得到编码具有所需活性或特性的蛋白质的DNA分子的方法，包括以下步骤：

(a)按照权利要求1的方法，在单克隆丝状真菌培养物或单克隆丝状真菌克隆中表达多种蛋白；

(b)在单个克隆培养物或克隆菌落中筛选具有所需特性或活性的蛋白；和

(c)从表现出所需特性或活性的克隆培养物或克隆菌落中分离DNA分子。

4.一种得到编码具有所需特性或活性蛋白的DNA分子的核苷酸序列的方法，包括以下步骤：

(a)按照权利要求3的方法从表现出所需特性或活性的克隆培养物或克隆菌落中分离DNA分子；和

(b)将上述DNA测序。

5.一种得到具有所需特性或活性蛋白的氨基酸序列的方法，包括以下步骤：

(a)按照权利要求4的方法，得到编码具有所需特性或活性蛋白的DNA序列；和

(b)将上述DNA序列转化成氨基酸序列。

6.一种从多种单克隆丝状真菌培养物或单克隆丝状真菌克隆中筛选具有所需活性或特性的代谢物的方法，包括以下步骤：

(a)按照权利要求1的方法，在单克隆丝状真菌培养物或单克隆丝状真菌克隆中表达多种蛋白；和

(b)在每个单一克隆培养物或克隆菌落中筛选所需特性或活性。

7.一种优化所需蛋白活性或特性的方法，包含如下步骤：

(a)提供一种包含编码蛋白质突变型的DNA序列的载体库；

(b)提供一种表型特征为可悬浮生长和在悬浮条件下产生可转移复制单元的丝状真菌株；

(c)使用上述DNA载体库稳定转化上述丝状真菌株，使每个单一菌株都至少含有一种编码外源蛋白的核酸序列；

(d)在有利于形成可转移复制单元的条件下培养转化的丝状真菌株；

(e)将各种不同的可转移性复制单元相互分离；

(f)在有利于由外源蛋白编码核酸序列编码的外源蛋白表达的条件下，培养成单一可转移复制单元的单克隆培养物或克隆菌落；

(g)在各生物体、克隆培养物或克隆菌落中筛选具有所需特性或活性的表达蛋白；

(h)分离一个或多个表达具有所需活性或特性蛋白的单一生物体、克隆培养物或克隆菌落；

(i)从编码表现所需活性或特性蛋白的分离的单一生物体、克隆培养物或克隆菌落中分离DNA，并对其进行突变。

(j)提供包含(i)步骤中得到的突变DNA序列的载体库；和

(k)重复步骤(b)到(g)直到所需活性或特性达到满意的水平或不再提高。

8.权利要求7的方法，在步骤(h)和(i)间进一步包含如下步骤：培养一个或多个在步骤(h)中分离到的单一生物体，克隆培养物或克隆菌落；分离表现出所需特性或活性的表达蛋白；对所分离蛋白的特定活性进行评价。

9.权利要求2的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。

10.权利要求3的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。

11.权利要求4的方法，其中筛选步骤为高通量筛选。