[发明专利]重组葡激酶(126)的制备方法

权利要求书

1、一种重组葡激酶(126)的制备方法，其特征在于以纤溶活性高的金黄色葡萄球菌为PCR扩增模板，将扩增出的葡激酶(126)基因片段插入pBV220载体质粒，转化大肠杆菌，构建成重组葡激酶工程菌株。

2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于扩增模板的筛选方法为：

取得金黄色葡萄球菌，接种于LB的液体培养基中，振荡过夜，离心、取上清，用于血纤维蛋白平板测定，似有溶解圈的，选其中纤溶活性最高的一株用作PCR扩增模板。

3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于葡激酶(126)基因扩增方法为：

取金黄色葡萄球菌单菌落，接种于LB液体试管培养基中，振荡过夜，离心、收集菌体，加入缓冲液，悬浮，煮沸，室温下离心分离，上清直接用作PCR反应。

4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于反应所用引物为：

上游引物为：5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT

下游引物为：5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC.

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于扩增反应步骤控制为：

       92℃         60秒

       50℃         50秒

       72℃         50秒

30个循环，然后72℃延伸12分钟。

6、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于葡激酶(126)基因的构建与鉴定方法为：

将PCR扩增出的葡激酶(126)基因片段插入pUC19载体质粒，转化大肠杆菌，涂于平板上，培养过夜；取白色菌落，接入LB的液体培养基中，培养过夜，提取质粒，用内切酶双酶解后，以琼脂糖凝胶电泳检查，构建成重组葡激酶工程菌株(pUC-SaK126)。

7、根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于葡激酶(126)表达质粒的构建方法为：

将pUC-SaK126质粒双酶解，以相同酶解的原核表达载体pBV220重组，转化大肠杆菌DH5α，涂于LB-AmP平板，培养过夜；提取质粒，酶切，琼脂糖凝胶电泳检查，含Sak126基因特征片断者，为表达质粒pBVS126。

8、根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于葡激酶(126)的分离纯化方法为：

细胞破碎，提取粗酶，超滤截流后，进行疏水层析得产品。