[发明专利]一种重组人肝细胞生长因子的制备方法

权利要求书

1、一种重组人肝细胞生长因子(rhHGF)的制备方法，其特征在于所述方法是将基因工程技术与蛋白质工程技术相结合，对HGF基因进行转录前加工、修饰，分别构建HGF重链(α链)表达体系和HGF轻链(β链)表达体系，分别表达HGF的重链蛋白和轻链蛋白，然后利用异源蛋白体外共复性技术，制备有野生活性的HGF蛋白。

2、按照权利要求1所述的制备方法，其特征是hHGFα原核表达体系的构建采取以下步骤：

A)根据真核基因在原核细胞中表达的要求和hHGF基因序列分析结果，设计合成一对引物，以HGF为模板，通过聚合酶链反应(PCR)，扩增得到相应序列并加上起始密码ATG、串联终止密码TAA、TGA及适于克隆和表达的酶切位点的hHGFαcDNA；

B)将hHGFαcDNA基因片段经合适的酶切重组到原核表达克隆载体上，构建得到含hHGFα的重组质粒。

3、按照权利要求1所述的制备方法，其特征是hHGFβ基因表达体系的构建采取以下步骤：

A)根据真核基因在原核细胞中表达的要求和hHGFβ基因序列分析结果，设计合成一对引物，以HGF为模板，经过PCR后，扩增得到含有翻译起始密码的ATG和SD序列及SD间隔，加上相应酶切位点的hHGFβcDNA；

B)利用相应的酶切位点将hHGFβcDNA定向克隆到原核表达载体上，经过筛选、限制性内切酶切，构建得到含hHGFβ的重组质粒。

4、按照权利要求1或2所述的制备方法，其特征是hHGFα蛋白质的表达和分离纯化步骤如下：

A)将构建的含hHGFα重链表达质粒用氯化钙等转化法转化至大肠杆菌中，经选用最适细菌生长和蛋白表达的发酵培养基培养，经诱导表达的方法，表达人肝细胞生长因子重链蛋白hHGFα，SDS-PAGE分析表达产物；

B)以包涵体形式存在于大肠杆菌中的表达菌体按一定比例重悬于Tris缓冲液中，加溶菌酶消化，超声破菌，加脱氧胆酸纳，离心取沉淀，将其重悬于尿素缓冲液中，离心弃上清，用含尿素的缓冲液II洗涤沉淀，将沉淀溶于含尿素的缓冲液，离心回收包涵体溶解液上清，用凝胶过滤层析进一步纯化，分部收集洗脱峰，SDS-PAGE鉴定目的蛋白所在峰。

5、按照权利要求1或3所述的制备方法，其特征是hHGFβ蛋白质的表达和分离纯化步骤如下：

A)将构建的含hHGFβ转化到大肠杆菌中，经选用最适细菌生长和蛋白表达的发酵培养基培养，用诱导表达的方法，表达人肝细胞生长因子轻链蛋白hHGFβ，SDS-PAGE分析表达产物；

B)以包涵体形式存在于大肠杆菌中的hHGFβ蛋白质的分离纯化步骤如下：

离心收集诱导表达的菌体，加入缓冲液，搅拌，使菌体分散均匀；加蛋白酶抑制剂、溶菌酶，搅拌，加脱氧胆酸纳；超声破菌，低温高速离心，沉淀中加入Tris溶液，搅拌，低温离心，沉淀重悬于尿素缓冲液；包涵体按浓度比加入含尿素的变性液中室温作用，离心沉淀，包涵体溶解液经凝胶过滤层析纯化目的蛋白，将纯度较高的收集液合并，用于复性。

6、按照权利要求1、4或5所述的制备方法，其特征是hHGFα与hHGFβ蛋白的体外共复性是采用梯度稀释的方法，将目的峰中蛋白质调至规定浓度，然后调整hHGF-α与hHGF-β蛋白的摩尔比，间隙使用含还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)的复性液，降低尿素的浓度，在透析液中充分透析，将透析后的共复性样品经离子交换层析纯化，最终得到有野生活性的HGF。