[发明专利]人DNA聚合酶β突变基因和对应蛋白

说明书

                    技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新的人基因核苷酸序列，具体涉及一种人类修复基因DNA聚合酶β的cDNA序列，是DNA聚合酶β在食管癌中的特殊表现形式，称为M-POLB，它所编码的蛋白完全丧失DNA聚合酶β的DNA修复活性，该蛋白称为M-POLB.AMI。即本发明涉及了该基因的cDNA编码序列、该核苷酸序列编码的多肽以及利用重组技术生产所述的新的M-POLB.AMI的方法。

                    背景技术

1971年Weissbach等从牛胸腺中分离出了一类不同于DNA聚合酶α的新的DNA聚合酶，并命名为DNA聚合酶β(Polymeraseβ，POLB)，其全称为依赖DNA的DNA聚合酶β。迄今为止它是真核生物中已知的五种DNA聚合酶之一。有人称其为生物进化过程中的“看家酶”^[1]。POLB是一种分子量为39kDa的小分子多肽，广泛存在于哺乳类动物细胞内，其功能主要是参与DNA的损伤修复(Dresler Sl et al，J Rio Chem，1983：258：9990-9994)。POLB分子结构和催化活性：POLB是广泛存于哺乳动物细胞核内，是一条由单条肽链小分子蛋白质，其分子量为39Kda，在溶液中以单链形式存在。人和啮齿类动物POLB的一级结构为一条由335个氨基酸组成的多肽，其2级结构中有10％的螺旋和50％ β片层(TanabeK et al，J Bio Chem，1981，256：3089-3102)。由四个亚基构成。POLB具有催化DNA聚合的作用，但它与其它DNA聚合酶不同，不具有3’→或5’→核酸外切酶活性，亦无焦磷酸置换，焦磷酸水解，dNTP和RNA水解功能。用蛋白裂解法证明该酶有两个不同的功能区(Beard Wa et al.Mutat Res 2000，30；460：231-44)：一个N-未端，约含有75个氨基酸；一个C-末端，约含有250个氨基酸，。在催化DNA聚合反应时，前者与模板结合，后者与dNTP结合。进一步研究表明，C-末端区分为三个亚区：一个“指部”亚区(88至151氨基酸)；一个“掌部”亚区(151至262氨基酸)和一个“拇指”亚区(263至355氨基酸)。N-末端具有切除脱氧磷酸残基的活性并与DNA模板及引物具有高度的亲和性；它的催化中心位于Lys72。而C-末端区具有核苷酸转移活性即聚合酶活性其中最重要的催化位点，位于掌亚区的190位和192位氨基酸的Asp以及拇指区256位氨基酸的Asp和283的Arg，它们均与核苷酸转移活性关系密切(M.R，Sawaya，et al，Science 1994，264：1930-1935)。更深入的研究表明：拇指亚区的运动对POLB的活性非常重要，在缺乏DNA和dNTP的情况下，位于盐桥中的Asp192与Arg258结合；而DNA和dNTP存在的情况下，拇指亚区与掌亚区接近，拇指亚区残基Glu295和Tys296以氢键结合到Arg258上，接着，Arg192从Arg258上解脱而连接上一个Mg²⁺，作为连接金属离子的核苷酸来激活核苷酸转移步骤。在催化反应过程中，需要Mg²⁺或Mn²⁺作为激活剂。与引物适当的结合形状、原料dNTP及POLB活性位点氨基酸残基均是该酶保真性的影响因素。其反应过程遵循BiBi机制：即它先和模板引物结合，再与dNTP反应，在双链DNA缺口中插入一个核苷酸时，再次与引物的3’-OH结合，开始第二轮反应。反应的最适PH在8.5-9.0范围内，高盐浓度(＞100mmol/L)对酶有激活作用，甘油和蔗糖对其也有激活作用。pH在4.5-10.5范围内该酶较稳定，若在酶溶液中加入蛋白质可以增加它的稳定性。它对许多试剂有抗性，如5M脲、磷酸乙酯、20％-50％Z醇和丙酮均可影响其活动。但是该酶的稳定性较差，在过热(＞42℃)时此酶更容易失去活性。某些抑制剂(如d₂TTP和d₂CTP)能特异性地抑制POLB的活性。综观现有研究结果，POLB参于DNA的聚合反应特点是：催化双链DNA上短小缺口中的DNA合成，当这些缺口在10个核苷酸下时它能将它们完成填补，对DNA双链上更大的缺口的修补，常常需要与其它修复酶共同参于。POLB还可能参与DNA的重组合成以及由单链DNA向双链DNA转化的过程。