[发明专利]一种新型DNA肿瘤疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物工程领域，具体涉及一种新型DNA肿瘤疫苗及其制备方法

技术背景

HER2/neu原癌基因，也称c-erbB2基因，是人类肿瘤中最常见发生变化的癌基因之一，主要表达在胚胎组织及某些肿瘤细胞中，如在乳腺癌，卵巢癌，胃肠道肿瘤，膀胱癌，非小细胞肺癌，肾癌中均存在HER2/neu原癌基因不同程度的过度表达或基因扩增，因此，HER2/neu原癌基因及其产物P185蛋白作为肿瘤治疗的靶抗原是近年来的研究热点。有研究表明，在某些肿瘤患者体内存在着针对HER2/neu的抗体及CTL反应，提示HER2/neu具有一定的免疫原性，可经过适当的免疫途径诱导机体产生针对HER2/neu的免疫应答，进而制备肿瘤疫苗。然而在大部分HER2/neu阳性的肿瘤病人中，未能检测出相应的免疫应答，表明对自体HER2/neu存在一定程度的免疫耐受。因此，要制作强免疫原性的肿瘤疫苗，必须对HER2/neu进行改造以超越机体对HER2/neu的免疫耐受，进而诱导特异性免疫应答，达到肿瘤防治的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型DNA肿瘤疫苗，可诱导机体产生针对HER2/neu阳性的肿瘤细胞的细胞免疫和体液免疫，产生良好的抗肿瘤效应。本发明的另一目的是提供HER2/neu基因特定片断的克隆方法和DNA肿瘤疫苗的制备方法。本发明的技术方案是通过下述步骤实现的：一克隆HER2/neu基因特定片断，构建表达载体

从HER2/neu高表达的细胞株SKBR3克隆出人ER2/neu特定片断基因。本发明采用RT-PCR法克隆人HER-2/neu的特定片断，利用NotI/XhoI双酶切定向插入到pcDNA3(商售)质粒中，构建人HER-2/neu基因真核表达载体pcDNA3-hSIDD。经测序证实获取了HER2/neu特定基因片断，表1是人pcDNA3-hSIDD的插入序列cDNA。用类似的方法同时得到大鼠HER2/neu基因特定片断的表达载体pcDNA3-rSIDD。

将HER2/neu基因特定片断的表达载体转染多种细胞系，用ELISA和流式细胞仪(FACS)检测发现该基因体外表达良好。将pcDNA3-rSIDD DNA注射在小鼠肌肉，经免疫组化染色证实注射部位的肌肉组织有HER2/neu的有效表达。二检测HER2/neu特定基因片断的免疫原性

完整的HER2/neu作为胚胎组织和肿瘤表达的“自身”抗原，机体对其有一定的免疫耐受性。上述特定基因片断并非天然的HER2/neu完整蛋白，但其中含有多个抗原表位，通过适当的免疫方案可以诱导机体产生相应的免疫应答。

本发明将pcNDA3-rSIDD免疫小鼠，用ELISA方法检测到抗HER2/neu抗体，且可持续数天时间，证明rSIDD可以引起体液免疫应答；用特异性杀伤实验证明pcDNA3-rSIDD DNA免疫的小鼠脾细胞对表达PCDNA3-rSIDD转染的肿瘤靶细胞有杀伤作用，若对该脾细胞在体外进行加强刺激，其对靶细胞的杀伤作用则明显加强，同时脾细胞表型出现明显变化，表现在T细胞明显加强，主要是CD₈⁺T细胞明显加强，而CD₄⁺T细胞比例无明显变化。说明rSIDD DNA免疫小鼠，可以诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答。

同样，通过DNA免疫技术，将人hSIDD DNA免疫小鼠，也可以诱导出相应的抗体和细胞免疫应答。经过肿瘤细胞的再刺激后，hSIDD DNA免疫小鼠脾细胞对人pcDNA3-hSIDD转染的肿瘤靶细胞表现出特异细胞毒作用，脾细胞中CD₈⁺T细胞的增加可能与此有关。说明hSIDD免疫小鼠，也可以诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答。

另外，本发明证明了这种免疫应答与HER2/neu蛋白的种属差异无关，而且能诱导针对外来抗原的免疫应答。通过交叉反应，即将人hSIDD DNA免疫小鼠，以大鼠rSIDD转染的肿瘤细胞作为靶细胞进行细胞毒试验，结果出现针对诱导抗原的免疫应答。

三、制备新型DNA肿瘤疫苗