[发明专利]细胞培养生产新疆雪莲总黄酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过组织和细胞培养生产新疆雪莲总黄酮的方法。具体讲是以植物细胞培养技术为手段，通过在细胞生物反应器内进行的新疆雪莲大规模细胞培养生产总黄酮的方法。本发明属于生物制药领域。

背景技术

由于新疆雪莲生长环境特异，天然生长缓慢，人工栽培困难，并且自然资源有限，难以满足临床上日益增长的需求，迫切需要采用新的手段来解决这一现实问题。植物细胞培养技术作为现代生物技术的一个重要分支，经过越来越多的学者的努力，已经呈现出良好的发展前景。进行新疆雪莲细胞的大规模培养，既可以解决天然资源匮乏的问题，又可以满足人们的健康要求。目前，我国已经有多家单位先后进行了雪莲细胞培养的研究，并取得了一些基础性的研究成果。

但是，在目前所能够见到的文献中，对新疆雪莲的研究大多数是集中在其化学成分、药理、生理功能、分析方法等方面上，在细胞培养方面罕有报导。印度有少数的学者进行了新疆雪莲保藏方法的研究，而中国科学院植物研究所的赵德修等人则对水母雪莲细胞培养的基础条件进行了较为系统的研究，并尝试在2升搅拌式生物反应器中进行了水母雪莲细胞的悬浮培养初步研究。

Arora R.等人发现，将雪莲种子放在含有0.5μmol/l NAA的MS培养基上诱导发芽时，其发芽比例可以达到90％。将诱导得到的雪莲芽在5℃的暗环境中储存12月并且不进行继代，其成活率为100％。如果将雪莲芽进行低温处理6个月或者更长的时间，然后将其放回培养间，会发现其生长速率比未经低温处理的芽的生长速率更快。

赵德修等人使雪莲种子萌发出幼苗，然后使用幼苗在MS、AG-7和B53种基本培养基上进行了愈伤组织的诱导，发现愈伤组织在MS外加0.2mg6-BA/l和2mg NAA/l的培养基上生长良好。在诱导得到的愈伤组织中，抗癌有效成分jaceosidin的含量为0.04mg/g干细胞，是天然水母雪莲原植物含量的25％。

赵德修等人在研究培养温度、苯丙氨酸对固体培养细胞的生长和黄酮形成的影响时发现，25℃有利于细胞的生长，苯丙氨酸对细胞的生长未见有促进作用，但是有利于细胞中黄酮的形成。经过高产细胞系的筛选，可以使细胞中总黄酮的含量达到1.9％，jaceosidin的含量为0.42％，分别是原始愈伤组织的2.6倍和4.2倍。

刑建民等人在2升搅拌式生物反应器中进行了水母雪莲细胞的悬浮培养。与摇瓶培养相比，雪莲细胞的生长速度明显下降，并且糖的利用也不充分，经过12天的培养，到结束时培养基中仍然在残留24.3g/l的糖。在培养的过程中，DO值变化很大，从培养开始的85％逐渐下降到第5--8天的30％左右，然后又开始回升，到第12天上升到50％。与摇瓶培养相比，雪莲细胞在反应器内的生物量和黄酮含量都发生了明显的降低，生物量从22.45g/l降到了10.35g/l，黄酮含量从占细胞干重的5.89％降到了4.14％，黄酮产率从1323.4mg/l降到了428.6mg/l。

分析上述已经进行的研究可以看出，它们都是单独从培养基成分或者培养条件着手来进行优化，而且所研究的试材均为水母雪莲。我们认为虽然基因型、外植体类型、培养基和培养条件都有各自不可忽视的作用，但是它们都是通过对愈伤组织或者培养的细胞的生理状态来起作用的，因而对培养的愈伤组织和细胞的生理状态进行调控才是最根本的手段。

我们经多年的时间，在分析、研究国内外雪莲研究成果的基础上，系统地研究了植物组织细胞培养技术应用到新疆雪莲有效成分总黄酮生产的理论、工艺及可行性，包括从材料选择、外植体诱导、高频细胞株的保存、悬浮培养系的建立到分离、纯化等过程，完成了实验室和中试研究，实现了一个培养周期可收获总黄酮4.12％(培养物干重)的结果，使下一步产业化更具有实际意义，并为此提供了可能与保障。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种提高新疆雪莲细胞大规模培养生产总黄酮的方法，该方法不仅能明显提高新疆雪莲细胞培养液中总黄酮的含量，而且更有利于达到产业化水平。

本项目经多年研究，根据新疆雪莲培养细胞生产总黄酮的特殊机理，首创了采用气升式细胞悬浮培养技术，很好地控制了细胞的生长过程，缩短了缓慢生长期，延长了平稳生长期，进而缩短了培养周期，降低了成本，提高总黄酮产量。为了实现本发明的目的，本发明的技术路线如下：

将新疆雪莲的外植体进行离体培养，筛选高产细胞株，转入细胞种子培养，然后进行细胞大规模培养。细胞培养液经过分离，纯化等处理，得到总黄酮晶体。