[发明专利]产L－精氨酸的大肠杆菌及生产L－精氨酸的方法

说明书

本发明涉及生产L-精氨酸的大肠杆菌和通过用大肠杆菌发酵生产L-精氨酸的方法。L-精氨酸是工业上有用的氨基酸，可以用作肝功能促进剂，氨基酸输注用品和各种氨基酸制品的成分。

已知一些抗精氨酸的类似物和吡啶的大肠杆菌的突变体可以生产精氨酸(Pierard A.and Glansdorf N.，Mol.Gen.Genet.，118，235，1972.and Glansdorf N.，Biosynthesis of arginine andpolyamines.In″E.Coli and Salm.thyphimurium，1996)。另外，还有一些使用抗其它药物的大肠杆菌突变体或重组大肠杆菌的菌株的方法，其中在重组的大肠杆菌中导入了一种编码精氨酸生物合成途径酶的基因。

在大肠杆菌K12的精氨酸的生物合成途径中，每消耗1摩尔的乙酰辅酶A，将释放1摩尔的乙酸和产生1摩尔的精氨酸(图1)。由于有乙酸副产品产生，相当部分的碳源被消耗了；此外，乙酸的积聚还恶化了精氨酸生产株培养物的生长。

还已知大肠杆菌不能有效的利用乙酸作为碳源。

根据以上的观点，本发明人设想如果生产精氨酸的菌株能够再利用乙酸的话，则精氨酸的产量可以会更高。因此，本发明的一个目的是提供能够利用乙酸的精氨酸生产菌株和利用该菌株生产精氨酸的方法。

于是本发明人就构建了能够利用乙酸并能够提高精氨酸的产率的大肠杆菌精氨酸生产者突变株。从而完成了本发明。

也就是说，本发明提供了能够生产精氨酸并能利用乙酸的大肠杆菌。

本发明还提供了生产精氨酸的方法，包括包括在培养基中培养能够利用乙酸和能够产生精氨酸的大肠杆菌以产生和积聚精氨酸的步骤，和从培养基中收集精氨酸的步骤。

在本发明中，氨基酸是L-构型的。

本发明将详述如下。

本发明的大肠杆菌能够利用乙酸并能够产生精氨酸。可以通过将利用乙酸的能力导入到能够产生精氨酸的大肠杆菌菌株或者通过将产生精氨酸的能力导入到具有利用乙酸能力的大肠杆菌菌株中从而得到同时能利用乙酸和产生精氨酸的菌株中。

对本发明来说，术语“能够产生精氨酸”指当本发明的大肠杆菌菌株培养在培养基中时能够在培养基中产生和积聚精氨酸。术语“能够利用乙酸”指相对于亲本菌株来说可以更有效的代谢乙酸或乙酸盐，例如，当该大肠杆菌菌株培养在含乙酸或乙酸盐作为唯一碳源的培养基中时，本发明所用的大肠杆菌菌株生长得比亲本菌株快。更具体的，可以这样说，如果该菌株在含乙酸或乙酸盐作为唯一碳源的培养基上培养时，其生长比亲本菌株快，就可以说该菌株可以利用乙酸；例如，在合适的条件下培养在含5g/l乙酸铵的液体基本培养基A中(如下文所述)。更具体的，当在合适的条件下，将该菌株培养在含乙酸或乙酸盐作为唯一碳源的培养基，例如，含有5g/l的乙酸铵的琼脂培养基上时，如果该菌株37℃，2天时形成了细菌菌落，就可以说该大肠杆菌菌株能够利用乙酸。术语“合适的条件”指温度，pH，空气供应或任选的对待培养的大肠杆菌菌株必需的营养。

作为获得本发明的大肠杆菌菌株的方法的一个例子，下面将介绍一个通过从一个能够产生精氨酸的大肠杆菌菌株诱导产生一个能够利用乙酸的突变体。

能够产生精氨酸的大肠杆菌的例子没用特别的限定，只要这样的大肠杆菌菌株能够被赋予利用乙酸的能力即可。这样的大肠杆菌的例子包括从大肠杆菌K-12，B，C或其衍生物培养得到精氨酸生产菌株。作为大肠杆菌精氨酸生产者的例子，可以列举如下：抗α-甲基甲硫氨酸，p-氟苯基丙氨酸，D-精氨酸，精氨酸氧肟酸盐，s-(2-氨乙基)-半胱氨酸，α-甲基丝氨酸，β-2-噻吩基丙氨酸或磺胺胍的突变体(日本专利申请公开56-106598)，导入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的精氨酸生产株等(日本专利申请公开57-5693)。下文实施例中所描述的大肠杆菌菌株237也是一个优选的精氨酸生产菌株。菌株237已经被保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，保藏号VKPM B-7925，保藏日期2000年4月19日，并且在2001年5月18日根据布达佩斯条约转移到国际保藏。

如上所述，可以从精氨酸生产株获得能利用乙酸的突变株，例如，对精氨酸生产株进行突变处理并筛选能在含乙酸或乙酸盐作为唯一碳源的培养基上生长的菌株。可以通过例如，紫外照射或用人工致突变剂如1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸进行突变处理。对能够利用乙酸的突变株致突和筛选可以重复2次以上。