[发明专利]用于特异性核酸检测和定量的同组异序引物延伸方法及其试剂盒

说明书

本发明涉及用同组异序引物延伸(iPE)法检测和定量特异性DNA或RNA的方法。

常规用于检测和定量核酸(如DNA和RNA)特异性序列的方法包括Southern印迹，Northern分析和RNA酶保护分析和聚合酶链式反应(PCR)及其他方法。但如果考虑到样品中的某个特异性RNA的检测，Northern印迹和RNA酶保护分析就存在以下缺陷：有效性有限、劳动强度大、精确度低、成本高、灵敏度低、需要较多的RNA样品、特定的设备，且将产生大量生物危险性和放射性废物。具体的说，Northern印迹和RNA酶保护分析都需要2-3天来完成分析。另外，Northern印迹需要RNA凝胶跑样、将RNA转移到固相载体上、制备探针、和进行杂交反应。敏感性则需要5μg样品以保证足够的敏感度。Northern印迹的理论基础是靶核酸与探针核酸间的杂交。另外，每次反应的成本非常高，而且产生的生物危险性和放射性废物的量也非常多。

类似的，RNA酶保护分析需要2-3天得到适合的结果。试验步骤需要制备模板DNA、制备RNA探针、进行杂交反应、酶消化反应和凝胶跑样。为了得到良好的结果，需要1μg靶RNA样品。RNA酶保护分析的理论基础是将杂交和酶消化反应联合。与Northern印迹方法相同，进行这种反应的成本也很昂贵。另外也产生大量生物危险性和放射性废物。表1列出了Northern印迹、RNA酶保护分析和本发明多引物延伸方法各种因素的比较。

美国专利No.5,846,710公开了用引物延伸方法来筛选变异的DNA分子。但该专利并未公开对样品中靶DNA或RNA的检测。

美国专利No.5,994,079公开了将DNA引物与特异性RNA退火形成RNA/DNA杂交体，并用逆转录酶延伸引物。用对RNA/DNA杂交体的特异性抗体检测杂交体。但该专利未公开如本发明所述的检测样品中靶DNA或RNA的方法。

可以看出本领域需要一种简单、节约时间的检测核酸的方法，而且这种方法敏感、成本低、有效，且对环境的影响小。以下所述的本发明满足了这些要求。

本发明满足了上述要求。

本发明涉及检测和定量样品中靶核酸的方法，该方法包括：

(a)制备特异性配对于靶核酸预定位点的一种或多种引物；

(b)在高度严谨条件下将(a)的一种或多种引物与靶核酸退火，在靶核酸预定位点得到引物-靶核酸双链体；

(c)将(b)的引物-核酸双链体与一混合物混合，该混合物含有：

    (1)一种或两种或三种类型游离非终止子核苷酸，和至少一种类型的非终止子核苷酸，它任选地标记有可检测标记物，和

    (2)有或无某一类型的终止子核苷酸，该核苷酸与(1)中的一种或两种或三种非终止子核苷酸不同；

(d)通过酶促或化学反应在适当的缓冲液中进行引物延伸；和

(e)检测或定量引物延伸的核苷酸上标记信号的量，或

(f)用质谱分析检测或定量延伸的引物的量。

在上述方法中，引物可以是一种核酸引物、寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。感兴趣核酸可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸或脱氧核糖核酸和核糖核酸的共聚物。

在一优选实施例中，该方法包括用含有如下非终止子和终止子核苷酸的组合：

(a)dATP、dCTP、dGTP、ddTTP或ddUTP，

(b)dATP、dCTP、dTTP或dUTP、ddGTP，

(c)dATP、dGTP、dTTP或dUTP、ddCTP，

(d)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP、ddATP，

(e)dATP、dCTP、dGTP

(f)dATP、dCTP、dTTP或dUTP，

(g)dATP、dGTP、dTTP或dUTP或

(h)dCTP、dGTP、dTTP或dUTP。

本发明的方法可使用至少一种标记有可检测标记物的非终止子核苷酸。可检测的标记物包括酶或蛋白质部分、放射性同位素、荧光部分或化学基团(如生物素)。另外，检测或定量方法的步骤中还可用质谱分析进行。

用于本发明引物延伸反应的酶包括模板依赖性酶，如大肠杆菌DNA聚合酶I或其克列诺片段、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、水生栖热菌DNA聚合酶、逆转录病毒逆转录酶、或它们的组合。

可从以下本发明的描述、附带的参考图和权利要求，对本发明的这些和其他目的有更全面的理解。