[发明专利]编码伤寒沙门氏菌特异性和抗原性外膜蛋白的DNA序列

说明书

本发明涉及的领域是与伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的特异性外膜蛋白(OMP)的编码基因(ST50)相关的基因工程学、诊断学和疫苗学。此蛋白的分子量估计为50kDa。通过编码这种蛋白的基因的基因工程，可以获得这种蛋白。

在大多数发展中国家，伤寒仍是一个公众健康的难题。现有的诊断此病常用方法由于太慢而不能使临床快速作出决定，所以仍然不能令人满意。培养方法虽然具有特异性，但它也缺乏灵敏度和速度。它在2-7天内才能得出结果，而且充分认识到有培养阴性的伤寒的病例。尽管已经广泛地应用了抗体检测试验(肥达氏试验)，但它也缺乏速度、灵敏度和特异性。该试验的有意义的解释必需在10-14天以后急性期和恢复期血清之间的抗体效价出现4倍的升高才能得出。理想的诊断伤寒的试验应当是快速而方便的，既具灵敏性又具特异性。上面所述的方法都不符合这些标准。因此需要开发一种快速且特异的试验。这种试验与灵敏的诊断结合，可对伤寒提供快速、有效和确切的处理方法。依快速诊断伤寒，随着50kDa OMP的发现，我们在伤寒的诊断方面已经取得了显著的突破。这种50kDa OMP对于病原伤寒沙门氏菌来说是特异的(Ismail A等。1991．《生物化学生物物理学研究通讯》27:301-5)。伤寒沙门氏菌外膜的特异性50kDa抗原的发现已经在马来西亚获得了专利(马来西亚专利第MY-106708-A号)。应用这种分离的OMP，我们成功地开发了一种快速斑点酶免疫测定法(TYPHIDOTTM)，以检测该细菌特异性IgM和IgG抗体的存在。此试验的灵敏度大于95％，具有一种较高的阴性预测值，并且可在1-3小时内得出结果。单独检测到IgM或同时检测到IgM和IgG提示为急性伤寒，而检测到IgG仅提出几种解释，诸如为恢复期或可能为再感染。由于对伤寒缺乏有效的免疫，在高流行地区的患者通常存在再感染。在目前再感染的条件下，会产生继发免疫反应，其中IgG超过IgM的显著的“加强免疫”效应，从而造成后者可能检测不到。解决这个难题的可能的策略是除去全部的IgG，而“揭示出”IgM的存在。这种3小时IgM检测试验(TYPHIDOTTM)的开发对高流行地区是非常有用的，因为它可区分出新病例和恢复期病例。研究各种试验的灵敏度、特异性和优势，由所得数据可以看出，与常用方法相比，这种试验能可靠地替代肥达氏试验。

为了大规模地生产这种蛋白，我们已经纯化并测定了50kDa OMP的氨基酸序列。基于这种发现，我们已经分离、克隆和测序了编码50kDa OMP的DNA。另外我们还通过表位定位确定了该蛋白的免疫原性表位。这个表位已经使50kDa OMP成功地应用于伤寒的诊断。

本发明提供了编码伤寒沙门氏菌50kDa OMP的遗传物质。此遗传物质可用于生产在诊断伤寒的方法中所用的蛋白。另外，这种遗传物质可用作检测伤寒沙门氏菌的一种探针。来源于此蛋白的完整蛋白或表位可用于伤寒的诊断和疫苗开发。更进一步的应用包括伤寒DNA/RNA疫苗的开发。

伤寒沙门氏菌50kDa OMP已经被插入两种不同的表达载体：pST50-USM1(附图1)和pST50-USM2(附图2)。这些克隆已经于2000年10月26日保藏在一个获批准的国际保藏单位，澳大利亚政府分析实验室，并且克隆pST50-USM1的登记号为NM00/16074,pST50-USm2的登记号为NM00/16075。

附图1是在TOP02.1克隆载体中的ST50克隆的质粒图。在图中标明了抗生素标记物氨苄青霉素(AmpR)、卡那霉素(KanR)、复制起始位点COLE1和F1ORI,以及ST50基因。此克隆的大小为5384bp。

附图2是在pRSETB表达载体中的ST50克隆的质粒图。在图中标明了抗生素标记物氨苄青霉素(AmpR)、复制起始位点FIORI和ST50基因。此克隆的大小为4401bp。

本发明人已经识别并首次获得了编码伤寒沙门氏菌特异性OMP的遗传物质，它先前只能以有限量获得。因为50kDa OMP是检测特异性IgM和IgG抗体及其它抗体种类的关键，以纯形式大量获得这种蛋白允许设计出伤寒的特异性诊断方法。而且，这种特异性遗传物质的识别和分离允许生产出新的伤寒疫苗。它还可成为特异性核酸探针的来源，这种探针可用于直接检测伤寒沙门氏菌的杂交技术。预测的起始密码子的第一残基标示为核苷酸7，表1描述的是其整个序列。表1伤寒沙门氏菌ST50基因DNA和氨基酸序列：