[发明专利]用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质血红蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种作为红细胞代用品使用的高纯度无热原无基质血红蛋白的制备方法。

背景技术

由于人类血型十分复杂，除各种抗原可能导致的输血免疫反应难以克服外，肝炎、艾滋病等多种可经血液途径传播的传染病对血液临床直接使用构成的威胁也越来越大，因而在各种临床医疗和急救中，对输血的质和量的要求越来越高。此外，人血的体外保存和运输问题也是影响将采集血液直接使用的重要制约因素。因此，研发和使用血液代用品已普遍受到重视。现在已明确，人类的血型反应来源于红细胞膜上的抗原种类的不同，去除了红细胞膜及其上所携带的各种血型抗原后的无基质血红蛋白(Hb)类红细胞代用品即可完全不存在配血型之忧，并且在制备过程中通过对病毒的灭活还可以消除各种随血液传播疾病的可能性。试验表明，此种无基质血红蛋白类红细胞代用品在一般室温条件下的贮存时间可长达一年以上，特别是其在性能上不仅具有与天然血相似的良好的携、释氧功能，且其粘度低，粒度小，对微循环周围组织的供氧能力还超过了天然红细胞，因而在心脑血管等缺氧性疾病的治疗以及紧急救治方面显示出了良好的发展前景。

虽然为解决以人体的血红蛋白为原料制备红细胞代用品中所存在的人血红蛋白的来源受限问题，有报导以大肠杆菌表达的基因重组人血红蛋白已经研究成功；也有报导从人血干细胞体外培养诱发出的人红细胞已在实验室初步完成，但这些技术在投入工业化生产都尚存在有工艺复杂和成本过高等方面的问题。因此，目前直接以动物血液或人体血液为原料制备血红蛋白类红细胞代用品仍是主要采取的途径和方式。在这些方面，目前资料已有报导的一种方法，是主要通过超滤和用丙烯葡聚糖凝胶柱S-100处理，然后经高压液相柱层析，最后通过亲合层析纯化血红蛋白的方法，可得到高纯度的血红蛋白溶液。但其方法操作工序较繁琐，导致成本过高，且回收率也较低。还有资料报导采用标准阴离子交换法和阳离子交换法，可使所制备的牛血红蛋白的纯度达到99％。这些方法普遍还存在血红蛋白的回收率低以及尚不适合于大规模工业化生产的问题。

已有文献报导，使血红蛋白处于脱氧状态能提高其对加热温度的耐受性。为此，曾有报导采用过饱和置换层析后，使血红蛋白与一氧化碳结合，以取代血红蛋白中所结合的氧，然后经巴氏消毒灭活病毒以及阴离子交换柱层析和阳离子柱层析处理，可得到高纯化的血红蛋白制品。由于血红蛋白与一氧化碳的结合力比氧约大150倍，因此用一氧化碳驱除和替换血红蛋白中结合的氧虽较为容易，但处理后使已结合的一氧化碳再与血红蛋白解离则显然更为困难。另有资料报导，对经溶血处理得到的粗制溶血液，用通入氮气、氩气等无氧惰性气体或真空的方式，使血红蛋白中所结合的氧充分施放后，再在加入还原性的谷胱甘肽、二硫苏糖醇(DTT)或次硫酸类化合物、连二亚硫酸类化合物、亚硫酸氢类化合物、硫氢类化合物等具有还原性的含硫化合物，并在保持脱氧状态下加热数小时至数天，以除去其中的非血红蛋白类的其它蛋白质成分并对病毒进行灭活的制备无基质血红蛋白的方法。该文献虽对有关脱氧、加热及病毒灭活等条件的研究作了说明，但未明确其对所得血红蛋白的纯度及其对制品的有关性能有无影响和/或改变。

发明内容

针对上述情况，本发明将提供一种操作方法和所需设备都大为简化，且能使制备时间周期缩短，成本降低的用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质血红蛋白制备方法。该方法制备所得的血红蛋白制品不仅可达到同样的高纯度与无热原要求，而且可以有较高的回收率。

本发明的用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质血红蛋白的制备方法，是在0℃-4℃条件下，在由天然血细胞经溶血处理得到的粗制溶血液中加入抗氧剂并调节溶液pH5.40-6.00后，充分脱除存在于血红蛋白中的结合氧和溶解氧后，在按与脱氧血红蛋白溶液重量/体积比为1-2％的量加入多羟基化合物作为保护剂的条件下，于50℃-60℃加热1-3小时，然后作常规过滤和超滤膜过滤处理并调整pH7.0-7.4。