[发明专利]结核杆菌基因芯片及其用途

说明书

本发明是关于一种结核杆菌的基因芯片及其用途，属生命科学领域，涉及一项分子生物学技术。

基因芯片(gene chip)又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，因此可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Southern blotting和Northern blotting)技术操作繁杂，自动化程度低，操作序列数量少，检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列，使用特定的分析方法，可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定，突变检测，多态性分析，基因组文章作图及杂交测序等。基因芯片技术是对传统生物技术，如检测，DNA杂交，分型和测序等技术的重大创新和发展。基因芯片技术将生命科学研究中所涉及的许多不连续的分析过程，如样品制备，化学反应和分析检测等，通过采用微电子、微机械等工艺集合到芯片中，使之连续化、集成化和微型化，这一技术的成熟和应用将给疾病诊治，药物研制和环境保护等生命科学相关领域提供强有力的新手段。

结核病是一种严重危害人类健康的传染性疾病，由结核分枝杆菌感染引起。目前全世界已有19亿人感染结核杆菌，每年新增结核病例800万，死亡300万，居各种传染病死亡人数之首。降低结核病发病率及死亡率的关键是早期诊断，耐药性检测，进而准确及时的提出一套合理、科学的治疗措施。结核杆菌属缓慢生长菌，目前鉴定、分离结核杆菌的方法仍沿用传统的细菌涂片，镜检等方法。这类方法耗费时间较长，大多需要数周甚至数月，并且对样品用量需求较大，难以在科研及临床上广泛使用。对于结核杆菌耐药性的检测，常规作药敏试验，则需耗费更长时间。尽管目前有些研究者提出了一些基因诊断的方法签定结核杆菌，如分子杂交、核酸扩增及染色体指纹等技术，但由于这些技术都存在一定的不足，如操作较为复杂，样品用量较大，特异性不高等，而难以在临床实际运用中推广。

本发明的目的是提供一种结核杆菌基因芯片，这种芯片克服了现有技术的不足之处，能够快速、准确、高效地鉴定结核杆菌，并针对结核杆菌对异烟肼、利福平、利福霉素及其衍生物、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、喹喏酮类等药物产生的耐药性进行检测和筛选。应用该技术有利于临床上对结核病的正确诊断和合理选用治疗药物。

本发明是根据结核杆菌基因组序列的特征及结核杆菌耐药性产生的分子机制，针对基因芯片的用途设计和选择探针，将许多特定的寡核苷酸片段作为探针，按一定方式有规律地合理布局探针阵列，优化探针，采用合成后点样方法将探针固定于支持物上，制成该芯片。其使用方法为将该芯片与待测的标记样品的基因按碱基配对原则进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描采集信号，并由计算机处理荧光信号，对每个探针上的荧光信号作出比较，进行定量分析，从而迅速得出所要的信息。基因芯片的探针选择和探针布局是基因芯片技术中关键的一步，它影响基因芯片的制作和基因检测，最重要的是影响检测特定基因或目标核苷酸序列的可靠性。本发明结核杆菌基因芯片的特点是：(1)、根据结核杆菌基因组序列的特征及结核杆菌耐药性产生的分子机制设计和选择探针，进行合理布阵，形成优化的探针阵列。(2)、能够快速、高效、准确地鉴定出结核分枝杆菌，并对其耐药性进行检测和筛选。(3)、该芯片操作简单，特异性及灵敏度较高，样品用量小，便于携带，适宜推广应用。

本发明的具体实施方案如下：

(1)、选择探针合理布局：根据芯片的用途设计和选择探针并合理布局探针阵列，形成优化探针(见附图)。

(2)、制作芯片：按照合成后点样方法，先合成探针，然后利用点样仪点样将探针固定于支持物上，制成结核杆菌基因芯片。

(3)、鉴定和检测：利用该结核杆菌基因芯片鉴定结核杆菌，针对结核杆菌对异烟肼、利福平、利福霉素及其衍生物、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、喹喏酮类等药物的耐药性进行检测。方法如下：首先将样品(可以是患者的痰液或血液标本)进行处理，提取样品总DNA将提取得到的样品总DNA进行标记，然后与结核杆菌基因芯片杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描采集杂交信号，并由计算机处理荧光信号，对每个探针上的荧光信号作出比较和检测，进行定量分析，从而可以得出结果：该患者感染的是否结核分枝杆菌，若感染的是结核分枝杆菌，则还可进一步检测出该结核分枝杆菌对哪一种(类)抗结核药物耐药。