[发明专利]一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原

说明书

本发明涉及生物技术。

机体免疫系统是由中枢淋巴器官、外周淋巴器官、免疫细胞和免疫分子所组成。免疫应答过程有赖于免疫系统中细胞间的相互作用，包括细胞间直接接触和通过释放细胞因子或其它介质的相互作用。免疫细胞间或细胞与介质间相互识别的物质基础是免疫细胞膜分子。免疫细胞膜分子的研究对于深入了解免疫应答机制，以及对临床某些疾病的诊断、预防和治疗都具有十分重要的意义。截止2000年8月份，美国FDA已经批准了5种识别免疫细胞膜分子的单克隆抗体用于临床疾病的治疗，另有几十种单克隆抗体正在进行临床试验。

本发明一种新的分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原，独特分布于混合淋巴细胞反应活化的CD4⁺、CD8⁺、TCRγδ⁺T细胞和活化的NK细胞，而在其它活化途径(如固相CD3刺激、PHA、PMA及PMA+A23187刺激)中，活化T细胞表面不表达该分子。其能够和CD3分子协同刺激T细胞活化。其独特的分布、表达规律和功能表明它是一种新分子。

本发明的技术路线：

混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞免疫BALB/c鼠，在加强免疫后3天，取脾，制备脾细胞悬液，和骨髓瘤细胞NS-1融合，用HAT选择性培养。通过间接免疫荧光标记和流式细胞术，筛选能够和混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞结合的杂交瘤上清，分泌阳性抗体的融合细胞被克隆化，得到了A2单克隆抗体。通过免疫荧光染色、流式细胞术和重导向细胞毒实验分析A2单克隆抗体所识别的活化T细胞表面抗原，表明其具有独特的分布、表达规律和功能。经生物素标记、免疫沉淀及化学发光鉴定其分子量为140kDa。

木发明分子量为140kDa的活化T细胞表面抗原表达于活化的T细胞亚群TCRγδ⁺T细胞，因此，可作为TCRγδ⁺T细胞的一个活化标志，在移植免疫的研究和临床治疗移植排斥反应中具有重要意义。

本发明技术路线的具体实施方式：

1．混合淋巴细胞培养(MLC)无菌抽取正常人外周血10毫升，肝素抗凝，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，按2ml完全培养基中含有1.5×10⁶PBMC和0.5×10⁶3000Rad照射过的Daudi细胞培养于24孔板中，37℃、5％CO₂孵箱培养7天，获取活化的T细胞。

2．细胞免疫混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞1×10⁷腹腔内注射免疫BALB/c鼠，4周内同法免疫2次，1周后，尾静脉内注射活化T细胞1×10⁷加强免疫，3天后，取脾融合。

3．单克隆抗体的制备加强免疫后3天，取脾，制备脾细胞悬液，和骨髓瘤细胞NS-1融合，用HAT选择性培养。通过间接免疫荧光标记和流式细胞术，筛选能够和混合淋巴细胞培养获取的活化T细胞结合的杂交瘤上清，分泌阳性抗体的融合细胞被克隆化，得到了A2单克隆抗体。

4．研究A2单克隆抗体所识别膜分子p140的分布

4.1人PBMC的活化：同1.方法获取人PBMC，按2ml完全培养基中含有2×106细胞培养于24孔板，分别加入PHA(4μg/ml)、PMA(40ng/ml)、PMA(40ng/ml)+A23187(0.9μg/ml)，另有一孔为已包被有CD3mAb(用8μg/ml浓度进行包被)。其中PMA、PMA+A23187两组培养48h，PHA、CD3 mAb两组培养72h，另有PHA刺激的PBMC通过加入rHuIL-2(100u/ml)维持培养至12天。同时还有一组混合淋巴细胞培养的细胞通过加入rHuIL-2(100u/ml)维持培养至12天。用于下面免疫双色分析的混合淋巴细胞培养细胞在刺激第一天时便加入rHuIL-2(100u/ml)。