[发明专利]一种人乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(AR-ACHE)及基因编码序列无效

专利信息
申请号: 01105781.5 申请日: 2001-03-23
公开(公告)号: CN1376798A 公开(公告)日: 2002-10-30
发明(设计)人: 张学军;杨磊;贺恒益 申请(专利权)人: 中国科学院上海细胞生物学研究所
主分类号: C12N15/55 分类号: C12N15/55;C12N9/16;C12N15/63;A61K38/46
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摘要:
搜索关键词: 一种 乙酰 胆碱酯酶 异构体 蛋白 ar ache 基因 编码 序列
【说明书】:

本发明涉及酶学和分子细胞生物学,尤其是关于参与细胞凋亡过程中的酶。具体地,本发明涉及一种人类各组织细胞在发生细胞凋亡时表达的乙酰胆碱酯酶异构体蛋白(AR-ACHE)及其核酸序列。

乙酰胆碱酯酶(EC 3.1.17,acetylcholinesterase,ACHE)是神经递质乙酰胆碱的水解酶,属于糖蛋白。主要存在于电鳐的电器官、哺乳动物的胆碱能神经、神经-肌接头、红细胞膜(Zakut-H;et al:J-Clin-Invest.1990,86(3):900-8)以及啮齿动物的巨核细胞血小板中(A.Shafferman and B.Velan,Multidisplinary approaches to cholinesterase functions.1992 Plenum Press,New York)。

人的乙酰胆碱酯酶基因位于7号染色体上(7q22),目前发现有3种不同的剪切形式:神经肌肉型、红细胞型和通读型(Soreq,H.et al.Proc Natl AcadSci U S A.1990,87,9688-92;Soreq,H.et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1994,91,7907-11)。乙酰胆碱酯酶在胆碱能神经系统的功能是水解神经递质乙酰胆碱,使之生成胆碱和乙酸。红细胞型和通读型的功能不清楚,也有报道认为乙酰胆碱酯酶具有丝氨酸蛋白酶的水解蛋白活性.。近年来,由于体外培养的肿瘤细胞株也检测到AChE mRNA的转录和化疗后的卵巢癌患者的血清检测到乙酰胆碱酯酶活性,有作者认为乙酰胆碱酯酶与肿瘤发生有关(Lev-Lehman-E,et al:Blood.1997,89(10):3644-53)。

老年性痴呆(AD)是退行神经性中较多见的疾病。虽然AD病人脑中的总ACHE活性是降低的,但在老年斑中和老年斑周围的ACHE活性却是升高的(Javier Saez-Valero et al.,J.Neurochem.1999,Vol.72,1600-1608;Opazo-G & Inestrosa-NC,Mol-Chem-Neuropathol.1998,33(1):39-49;MimoriY.et al.,Behav Brain Res.1997,83(1-2):25-30.),而且,与神经递质降解功能无关。已经证明发现老年性痴呆患者病灶处有凋亡细胞存在,在长期研究细胞凋亡过程中,发现哺乳动物包括人类的一切细胞株,除了红细胞外,经过诱导,启动凋亡过程中表达乙酰胆碱酯酶异构体,这个结果可以很好注释上述现象。我们已经申请了该类酶的获得方法(张学军等,中国专利申请号97 1 25216.5,发明专利证书第61260号)和部分功能(张学军等,中国专利申请号97 1 25220.3,公开号CN 1186859)的专利。本发明采用RACE等方法,获得了AR-ACHE的cDNA全序列。

本发明的第一目的就是提供一种新的人基因乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)(Genbank Accession No.AF334270未公开),该基因是一个人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白基因。

本发明的第二目的是提供一种利用重组技术生产上述的新的人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白和核酸序列的方法。

本发明还提供了这种人乙酰胆碱酯酶异构体(AR-ACHE)蛋白多肽和编码序列的应用。

本发明使用了体外培养的SK-N-SH,人肺成纤维细胞(HLF)、K562等细胞株,用DMEM,1640培养基,添加10%小牛血清,在37℃,5%CO2,培养箱培养。诱导细胞凋亡方法有3种:自然衰老法,UV-B和化疗药物诱导法。自然衰老法,培养细胞,3-4天不换培养液,这时,贴壁生长的细胞,部分失去贴壁能力,进入了凋亡过程,收集这时的细胞。药物诱导法用抗肿瘤药物或低血清或去细胞因子等方法诱导细胞凋亡。对于细胞因子依赖的细胞株,入M07e巨核细胞株,只要在培养液中不加入GM-CSF,2-3天后,大量细胞发生凋亡,收集这时的细胞。UV-B诱导10分钟,培养18小时后可收集凋亡细胞。全过程的具体操作如下:

总RNA提取:

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