[发明专利]重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂

说明书

本发明涉及重组高效复合干扰素(Recombinant Super Compound Interferon,rSIFN-co)，的应用。

重组高效复合干扰素是将几种天然人α-干扰素亚型中最常见的保守性氨基酸结构用遗传工程的方法以建构而成的一种全新干扰素分子，美国专利4695623、4897471中对此种干扰素已经有所描述，已证明rSIFN-co具有广谱的干扰素活性，有较强的抗病毒和抗肿瘤及天然杀伤细胞活性，美国专利5372808公开了用重组高效复合干扰素治疗疾病的方法，中国专利97193506公开了应用重组高效复合干扰素再次治疗丙型肝炎的方法，中国专利98114663公开了重组高效复合干扰素的制备方法和治疗乙型肝炎和丙型肝炎的用途。美国食品与药品管理局(FDA)已于1997年底批准了美国Amgen公司用大肠杆菌生产的rSIFN-co用于临床丙肝病人的治疗。对于乙型肝炎病人的诊断，当检测出表面抗原(HBsAg)阳性和e抗原(HBeAg)阳性者即可判定为乙型肝炎患者，目前临床上采用各种类型的α-干扰素对慢性乙型肝炎患者进行治疗，其作用机理是：干扰素与细胞表面的特殊膜受体结合而发挥其抗DNA和RNA的作用。包括对某些酶的诱导作用阻止受病毒感染细胞中病毒的复制。但用干扰素治疗乙型肝炎的疗效始终未被证实。本发明惊奇的发现，重组高效复合干扰素对于乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原具有有效的抑制作用，从而证明重组高效复合干扰素可以通过抑制乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原达到治疗乙型肝炎的目的。

本发明的目的是提供用于治疗乙型肝炎的重组高效复合干扰素药物，通过服用这种药物抑制乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原，使之降低到正常水平，达到治疗目的。本发明是通过以下方式实现的：本发明首先通过基因重组技术制备出具有如图一序列的重组高效重组高效复合干扰素，本发明的重组技术利用大肠杆菌优先表达密码子，在保证氨基酸序列不变的情况下，对其DNA编码序列进行了重新设计，然后人工合成其rSIFN-co全长的cDNA基因。本发明采用重组DNA技术将上述rSIFN-co全长cDNA序列克隆到大肠杆菌高效表达载体中去，然后利用L-阿拉伯糖诱导/活化表达调控机制激活载体中的强P_BAD启动子介导下游的rSIFN-co基因高效表达。这一阿拉伯糖诱导/活化表达调控系统比通常遗传工程生产中所采用的温控、pH调控、IPTG诱导等系统有明显的优点：(1)通常采用的几种调控系统都是以“去阻遏”的形式解除对功能启动子的抑制作用，从而启动子可介导下游基因的表达。改变温度、pH值本身以及加入IPTG诱导物等都对启动子无直接激活作用。在我们采用的系统中，阿拉伯糖与阻遏蛋白(AraC)结合后，不仅解除了对P_BAD启动子的抑制作用，同时“阿拉伯糖-AraC复合物”又可直接激活P_BAD启动子介导下游基因的表达。所以阿拉伯糖诱导/活化调控系统是一种比其它几种系统更有效的大肠杆菌高效表达系统；(2)P_BAD启动子活化的程度与加入的L-阿拉伯糖剂量成线性关系。这样可以直接通过改变阿拉伯糖浓度而调节外源基因产物的表达量。这一特性对改变包涵体的形成等非常有意义。加入阿拉伯糖比改变温度/pH等更容易直接控制外源基因产物在大肠杆菌中的表达；(3)L-阿拉伯糖来源丰富，价廉、无毒性，这克服其它诱导物如IPTG在这方面的缺点。

本发明用阿拉伯糖诱导/活化系统建立了高效、稳定的rSIFN-co表达大肠杆菌工程菌株，通过对该菌株在适宜的条件下的培养发酵获得了大量高纯度的rSIFN-co蛋白以用于本发明的研究和临床治疗。

本发明的应用方法是通过患者服用重组高效复合干扰素达到治疗目的，患者服用的重组高效复合干扰素可以制成各种剂型如：片剂、胶囊、口服液、贴剂、注射剂、喷雾剂、栓剂、溶液制剂，推荐的剂型为注射剂，可皮下或静脉注射给药，药物组合物中的载体可使用任何一种适宜的药物可接受的载体，这些载体可以是糖类、纤维素制品、粘合剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、增溶剂、缓冲剂、防腐剂、增稠剂、配合剂和其他佐剂。

图一：为rSIFN-co的DNA编码序列以及推断的氨基酸序列

本发明通过以下实验验证了重组高效复合干扰素对乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制作用，实验方法如下：

溶剂及配制方法：受试药物配制时向每支原料瓶内加入1ml生理盐水，溶解后，再根据所设不同剂量组浓度差异用MEM培养液调配。现用现配。保存条件：4℃冰箱保存。