[发明专利]一种金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法

说明书

本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的金黄色葡萄球菌的培养物及其制备方法。

本领域技术人员熟知金黄色葡萄球菌的培养物中含有抗肿瘤成分，其主要的有效成分含有金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxin，SE)目前认为这种毒素是一种生物活性极其强大的超级抗原(superantigen，SAg)。现有文献中报道的超级抗原来源包括细菌，病毒和寄生虫等等。超级抗原的含义，作用以及作用机制完全不同于现今所有的普通抗原，或者称一般抗原。超级抗原是一类来源复杂的蛋白质，它在免役应答中只需要微量即可，例如可按照ngM计算。这种抗原利用非常独特的机制刺激T细胞大量增殖，产生大量的细胞因子，其表现的细胞毒性为：(一)直接激活细胞毒性T淋巴细胞，使之对靶细胞产生杀伤作用；(二)通过细胞因子的作用，激活NK细胞；(三)借超级抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(Superantigen dependentcell-mediated cytotoxicity，SDCC)，杀伤肿瘤细胞。

今年来，证实超级抗原具有抗肿瘤作用后，接着用化学方法合成McAb-SEA结合物，最后采用重组技术制成融合蛋白。这种融合蛋白于1997年进行I期临床试验，其结果表明：一次计量达1.5ng/kg是安全的，但是病人全身反应较大，大多数接受治疗的病人白细胞数量明显减少，血小板数量减少者更甚。

为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种新的金黄色葡萄球菌菌株。

本发明的另一目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的培养物及其培养方法，以及培养中采用的培养基。

本发明的另一目的在于提供所述的金黄色葡萄球菌的培养物具有抗肿瘤作用的用途。

本发明采用金黄色葡萄球菌菌株，在新的培养基中发酵培养制备一种培养物，该培养物具有抗肿瘤作用。本发明方法中培养基配方简单，有效地减少了原料使用量。其治疗用的培养物滤液可以不再进行灭菌处理。菌种产生酶的稳定性提高。使用本产品后，使用者的白细胞数量大大增加，提高抗肿瘤的效果。

本发明中所涉及的金黄色葡萄球菌菌株(staphylococcus aures)已经于2000年9月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC 0485。

菌株CGMCC No.0485的来源是从医院临床细菌检验室的标本中分离得到的100多株葡萄球菌中筛选得到菌株CGMCC No.0165后，再经亚硝基胍诱变，选育得之。

菌株CGMCC No.0485的形态特征：

形态特征：

金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定的细胞经透射电子显微镜放大2万倍(包埋法)和6万倍(超薄切片法)可看到细胞均成球行，直径0.5-1.0μm，单个，成对排列，具特征性的多于一个平面分裂，形成不规则的堆团，无鞭毛，不运动，不形成夹膜，不产生芽孢。在电子显微镜(超薄切片法)下，细胞壁、细胞膜、染色质均可见，不同生长期细胞的大小、结构有所不同，但金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株并无明显区别。

培养特征：

血平皿培养，菌落成圆形，突起，表面光滑，边缘整齐，不透明去，菌落呈金黄色，有大而透明的溶血环，35℃培养24hr，菌落直径约1.5-2.0mm。

液体培养基中生长物最初浑浊，后来变清，并具有细的，易悬浮的沉淀，培养2-3天时常有环状的膜，液体培养物在相同条件下，浊度略小，菌浓度略低。

染色特征：

用标准革兰氏染色法对金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株进行染色，在显微镜下观察，实验结果金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株均为革兰氏阳性菌。

用夹膜染色法对金黄色葡萄球菌标准菌株和待定菌株进行染色，在显微镜下观察，实验结果金黄色葡萄球菌标准菌株和待定菌株均为阴性。

用芽孢染色法对金黄色葡萄球菌标准菌株和待定菌株进行染色，在显微镜下观察，实验结果金黄色葡萄球菌标准菌株和待定菌株均为阴性。

生理生化特征：

血浆凝固酶阳性，在培养基中产酶能力很强。

葡萄糖、甘露醇发酵实验，产酸能力较弱。

培养物除菌后的滤液热源合格率高，可达95％以上。

水解淀粉试验：金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株均呈阴性。

过氧化氢酶实验：金黄色葡萄球菌标准菌株和待鉴定菌株均呈阳性。

本发明的制备方法包括以下步骤：

(1)将原料猪心加入1～2倍水中粉碎、过滤、得第一滤液和滤渣；