[发明专利]一种编码人溶菌酶的基因的DNA序列及其应用

说明书

本发明所属的技术领域是生物技术领域。

本发明涉及编码人溶菌酶的一种DNA序列以及此序列的植物表达载体、由此表达载体转化的植物细胞和由这些转化细胞产生的抗病原菌的转基因植物及其后代，包括植物种子、完整植株及植物体的器官、组织和细胞。

本发明的技术背景：

细菌、真菌和病毒是危害农作物的三大病害。其中细菌和真菌病害是世界范围内制约农作物产量的重要因素。尽管采用了多种防治措施，全球因病害造成的损失仍占粮食总产的12％。

由于植物病原微生物对各种农药逐渐产生抗药性，并且，由于农药易造成环境污染，残留的农药进入食物链后又会对人和动物的健康造成损害，因而，农药的使用受到限制。长期以来，人们一直借助传统育种方法来培育具有抵抗不同病害的新作物品种，然而，由于传统育种周期长、病原菌变异迅速和可利用的抗源匮乏等原因，致使传统育种方法难以满足需要。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性就成为一条崭新途径。

真菌和细菌细胞都具有细胞壁结构，细胞壁位于细胞表面，具有保护细胞免受机械性或渗透压的破坏、维持细胞外形的作用。

几丁质和肽聚糖分别是真菌和细菌细胞壁的主要成分。在植物、动物和微生物中都存在可降解几丁质和肽聚糖的几丁质酶和溶菌酶。利用外源几丁质酶和溶菌酶是基因工程抗病育种的一个重要方向。

几丁质酶可催化水解几丁质多聚体N-乙酰葡萄糖胺间的β-1,4-键。Broglie等(Broglie等，Science,254:1194-197,1991)把菜豆液泡几丁质酶基因导入烟草和油菜，使转基因植株对Rhizoctonia solani(立枯丝核菌)具有一定抗性，与对照相比发病轻，死亡率明显降低。之后，在烟草中又有类似报道(Zhu等，Bio/technology,12:807-812,1994；Jach等，Plant,J.,8:97-109,1995)。Lin(Lin等，Biotechnology,13:686-691,1995)和Nishizawa等(Nishizawa等，Theor.Apl.Genet,99:383-390,1999)将水稻Ⅰ类几丁质酶基因分别导入籼稻和粳稻，转基因水稻对R.solani(立枯丝核菌)和Magnaporthe grisea(水稻稻瘟病病原真菌)的抗性显著提高。相同的基因也介导了黄瓜对灰霉病的抗性(Tabei等，Plant Cell Rep.,17:15-164,1998)。

溶菌酶，又称胞壁质酶，可以水解N-乙酰胞壁酸与β-N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键。

T4噬菌体溶菌酶对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的杀菌活性，表达T4噬菌体溶菌酶的马铃薯对马铃薯软腐病病原菌Erwinia carotovora ataoseptica(胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐致病型)产生一定抗性(During等，Plant,J.,3:587-598,1993)。

人溶菌酶(human lysozyme，以下简称HL)是人体内的一种非特异性免疫因子，由130个氨基酸残基组成，分子量为14.7kD。人溶菌酶是一种双功能酶，它既能催化水解细菌细胞壁中肽聚糖的β-1,4-糖苷键，还可降解真菌细胞壁的几丁质。它的溶菌活性比较高，是鸡蛋清溶菌酶的2.5倍。它也是所发现的动物溶菌酶中唯一的双功能酶(Jolles和Jolles,Molecular and cellular Biochemistry,63:165-189,1984)。

表达人溶菌酶基因(按细菌偏爱密码子优化合成)的转基因烟草对病原真菌Erysiphe cichoracearum(菊科白粉菌)和细菌P.syringae pv.tabaci(丁香假单胞杆菌烟草转化型)都表现出较强的抗性(Nakajima等，Plant Cell Rep.,16:674-679,1997)。表达人溶菌酶基因(按细菌偏爱密码子优化合成)的转基因萝卜高抗两种主要病原菌Erysiphe heraclei(独活白粉菌)和Alternaria dauci(胡萝卜链格孢)(Takaichi和Oeda,Plant Science,153:135-144,2000)。

基于HL的双酶活性，本发明试图将其应用于植物抗病育种中。但由于人HL基因中的许多密码子并非植物偏爱密码子，因此不适合在植物中高效表达。

为提高HL在植物中的表达效率，本发明按照植物偏爱的密码子，同时考虑影响mRNA稳定性的因素，修饰合成了适于在植物中表达的HL基因。