[发明专利]一种人干扰素α突变体

说明书

本发明为人α干扰素类似物(IFNal)及其制备方法和用途，它具有抗病毒比活性高于5×10⁹IU/mg的特点，具有治疗和预防病毒性感染疾病的巨大潜力。

干扰素为小分子量的蛋白多肽，具有抗病毒和免疫调节的功能，可用于临床治疗病毒性疾病、肿瘤等。人干扰素分为三大类即α、β和γ型，分别由白细胞、成纤维细胞和淋巴细胞产生而命名。人α干扰素由165个氨基酸组成，分子量在19000道尔顿左右。现有的α干扰素制剂的临床治疗效果尚不理想，其抗病毒比活性仅为1×10⁸IU/mg，存在着大剂量时副作用较大的缺点。目前已经发现人α型干扰素亚成员有约20种，可用基因工程手段生产出相当数量的各种人α干扰素衍生物或类似物。其中最引人注目的是复合型α干扰素(concensusinterferon)，由165个氨基酸组成的重组复合型α干扰素由美国Amgen公司发明(商品名Infergen)，已批准用于治疗慢性丙型病毒性肝炎，疗效显著。Infergen是根据10个已知的人α干扰素亚型的氨基酸序列中氨基酸同源性高的原则组合而成，再经人工合成其相对应的基因，经大肠肝菌表达纯化而得，但有结构不均一性的缺陷。重组复合型干扰素的抗病毒比活性是目前发现的任何一种天然α型干扰素的10倍，比活性在1.0×10⁹单位以上。

本发明中人α干扰素类似物由171个氨基酸组成，抗病毒比活性达到5×10⁹IU/mg以上，比复合型α干扰素强5-10倍，比天然α干扰素强50-100倍。其氨基酸序列特征在于其N-末端比天然α干扰素多出5个氨基酸是GlySerGlyGlyGly，从第6位到171位氨基酸序列和组成同人α干扰素亚型成员的氨基酸序列。人α干扰素类似物的二对二硫键位于Cys7与Cys35，Cys54与Cys74之间，不处于其N末端第一氨基酸位置，十分有利于这二种二硫键的形成和稳定。本发明所述人α干扰素类似物IFNal采用分泌型融合表达的方式，加上第一对二硫键位于Cys7和Cys34之间，因此有效地避免了变性和复性的过程对二硫键形成的影响，保证了二硫键的最佳构象形成。同时，第171位(C末端第1位)氨基酸用Asp同源取代Glu，经实验证明可有效防止C末端的降解，保证了IFNal终产物是含单一的171个氨基酸的重组IFNal及其生物活性的稳定性。实例一.α干扰素类似物IFNal的基因获得

根据α干扰素类似物IFNal的氨基酸序列选择大肠杆菌偏爱密码子，清除不利于表达的二级结构设计和密码子的简并性，设计以下DNA序列：GGATCCGGTGGTGGTTGTGACCTGCCGCAGACTCATTCCCTGGGTAACCGTCGCGCTCTGATCCTGCTGGCACAAATGCGTCGTATCAGCCCGTTTTCTTGTCTGAAGGATCGTCACGACTTTGGCTTTCCGCAAGAAGAATTCGATGGCAACCAGTTCCAGAAAGCACAGGCTATCAGCGTACTGCATGAAATGATCCAGCAAACCTTCAACCTGTTCTCCACTAAAGATAGCTCTGCTGCATGGGACGAAAGCCTGCTGGAGAAATTCTACACCGAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCATGCGTAATTCAGGAAGTAGGTGTAGAAGAGACTCCGCTGATGAACGTCGATTCTATCCTGGCAGTTAAAAAGTACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACTGAAAAAAAGTACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTAGTTCGTGCTGAAATCATGCGTTCCTTCTCTCTGTCTACTAACCTGCAAGAGCGTCTGCGTCGTAAGGACTAGTAAGCTT