[发明专利]马传染性贫血病毒弱毒疫苗株的感染性分子克隆

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是马传染性贫血病毒弱毒疫苗株(EIAV DLA)全长前病毒基因组的克隆及其感染性分子的构建。

含有该EIAV DLA感染性分子克隆质粒的菌种已存入中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC NO.0501。菌种名称为EIAV-p8.2，分类为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏日期为2000年11月7日。

马传染性贫血(Equine Infectious Anemia，EIA以下简称马传贫)是由逆转录病毒科慢病毒属的马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)感染马属动物引起的一种烈性传染病。1843年Lignee在法国的一份兽医学报告中描述了第一例马传贫。患马呈反复发热，出血，贫血，黄疸，消瘦，浮肿等症状，并且以病毒持续感染为特征。1904年，Vallee和Carre证实该病是由一种滤过性病毒引起的。马传贫是最早被证明由病毒所致的传染病之一。

EIAV是正链RNA病毒，病毒基因组由两条线状的RNA组成，两条链通过氢键形成二聚体。EIAV基因组结构与其它慢病毒相似。病毒RNA编码三个主要结构基因gag、pol和env，此外还有几个小开放阅读框架(S1、S2、S3)，其中gag和pol基因部分重叠。病毒RNA基因组两端是完全相同的重复区(R区)，在5’R下游是5’独特区(U5)；3’端R区上游是3’独特区(U3)。R-U5和U3-R构成了病毒基因组两端的非编码区。EIAV感染宿主细胞后，经自身编码反转录酶的作用，合成病毒cDNA。EIAV cDNA可以整合到宿主细胞基因组中形成前病毒。EIAV前病毒DNA具有长末端重复序列(Long Terminal Repeat，LTR)位于前病毒DNA的两端，包括R、U3、U5三个区。其排列顺序为5’-U3-R-U5-3’。EIAV前病毒基因组结构见示意图1。

慢病毒是严重危害人类和动物健康的一类病原体，这个家族还包括：艾滋病的病原人免疫缺陷病毒(HIV-1&HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、绵羊梅迪-维斯纳病毒(MVV)和山羊关节炎脑炎病毒(CEAV)。这一类病毒在基因组结构、复制的分子机制、病毒的生活周期、抗原漂移规律、免疫机理及病毒与宿主相互作用等方面都很相似。

以EIAV为致病因子的马传贫自发现以来，在世界范围内各养马国家广泛分布与流行。马传贫呈地方性流行，但有时也在小范围内爆发，本世纪50年代到80年代末，马传贫的流行使我国经济蒙受了巨大的损失。在美国，马传贫病毒的传播是通过有计划的检疫及大规模的捕杀计划得以控制的。尽管如此，在世界其他地方，由于缺乏有效的疫苗，马传贫仍然是一个令人头疼的问题。

近年来，艾滋病在全球范围内迅速蔓延。据联合国近日公布的报告显示，到今年12月，全球艾滋病患者和病毒携带者总人数达3610万，仅今年新增的艾滋病感染者和发病者就达530万，相当于平均每天有近1.5万人感染艾滋病。随着艾滋病在世界范围的流行，人类面临着十分严峻的威胁。但由于慢病毒的自身独特性质即病毒的持续感染和高度变异性，使得慢病毒特别是HIV疫苗研制存在严重的障碍。目前还没有有效治疗艾滋病的药物和特异性预防疫苗。迄今为止，国外还没有研制成功有效的慢病毒疫苗。

得益于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所科学家们的潜心研究，本世纪70年代，世界上第一个慢病毒减毒疫苗——马传贫驴白细胞弱毒疫苗诞生了。该疫苗免疫动物不但对同源毒株有效，而且可以抵抗异源强毒攻击，强毒攻击后免疫动物不受感染并产生持久坚强的免疫力。在中国及古巴的广泛应用使两国马传贫已得到有效的控制，并在世界范围内开创了慢病毒疾病免疫预防之先河。

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株是将EIAV L株通过驴体传代，使其毒力明显增强，获得EIAV驴强毒，然后在驴白细胞培养物上连续传代致弱获得的。马传贫弱毒疫苗的成功应用，证明了慢病毒防制的现实可行性。

EIAV是遗传结构最简单的慢病毒，已构建成功多株不同毒力的感染性分子克隆，EIAV感染的潜伏期只有几天至几周，而且在EIAV感染过程中新的抗原变异株的出现与疾病的复发相关，因此是研究人及其他动物慢病毒理想的替代模型。我国具有自主研制开发的马传贫驴白细胞弱毒及其亲本驴强毒和原始L系EIAV。因此在分子水平上揭示强弱毒株间的基因表达调控，抗原变异，免疫机理，无疑对包括艾滋病病毒在内的人及其它动物慢病毒的免疫预防及治疗具有重要的理论意义和参考价值。