[发明专利]将二倍体转变成单倍体用于遗传诊断

说明书

本发明得到了美国政府基金的资助，即NIH拨款CA43460、CA57345、CA62924、CA67409、CA72851。因此，美国政府保留对本发明的某些权利。本申请要求1999年10月8日提交的临时申请流水号60/158,160的收益，而且是1999年12月15提交的专利申请流水号09/461,047的部分继续申请。

                    发明背景

至少就遗传诊断而言，人类和其它哺乳动物的问题在于它们是二倍体。一个等位基因中的突变(诸如负责所有显性遗传综合症的突变)总是伴随着第二个等位基因的野生型序列。虽然在过去的十年里已经开发了用于遗传诊断的许多有力技术，但是它们都受到模板中存在的二倍性的限制。例如，与突变型条带具有相同电泳迁移率的野生型条带能够使测序梯的解释变得复杂，尤其是在突变型条带的亮度较弱的时候。DNA区段的删除甚至更成问题，因为在这种情况中只有野生型等位基因通过标准技术得到了扩增和分析。这些问题呈现了诊断单基因疾病的困难，而对多基因疾病甚至更成问题，其中作为原因的突变可发生于几种不同基因之任一种。这种多基因机制是常见易感性综合症的规则而非例外，诸如与乳腺癌和结肠癌、失明、以及血液学、神经学、和心血管疾病有关的综合症。遗传诊断这些疾病的灵敏度目前不是最佳的，其中30％-70％的情况难于遗传分析。

本领域需要简单的分离和分析来自人类和其它哺乳动物细胞的单个等位基因。

                       发明概述

本发明的一个目的是提供用于检测人类或其它哺乳动物染色体上目的基因中的突变的方法。

本发明的另一个目的是提供用于使待测细胞适用于灵敏的遗传测试的方法。

本发明的还有一个目的是提供可用于遗传分析的融合杂交细胞群体。

下文所述一个或多个实施方案提供了本发明的这些和其它目的。在一个实施方案中，提供了用于检测人类或其它哺乳动物目的基因中的突变的方法。使人类或其它哺乳动物的细胞融合啮齿类细胞受者，以形成人类-啮齿类或其它哺乳动物-啮齿类杂交细胞。通过选择啮齿类染色体所含第一种标记和第一人类或其它哺乳动物染色体所含第二种标记来选择融合后杂交细胞，以形成融合后杂交细胞群体。在融合后杂交细胞群体中检测对于第二人类或其它哺乳动物染色体而言是单倍体的杂交细胞亚群。该第二人类或其它哺乳动物染色体与第一人类或其它哺乳动物染色体是不同的而且没有选择。测试杂交细胞亚群以检测基因、所述基因的mRNA产物、或所述基因的蛋白质产物。该基因位于第二种人类或其它哺乳动物染色体上。mRNA或蛋白质产物的量减少或者基因、mRNA、或蛋白质产物的特性改变指示人类或其它哺乳动物的该基因中存在突变。

依照另一个实施方案，公开了为遗传测试提供待测细胞的方法。待测细胞对于人类或其它哺乳动物基因而言是单倍体。使人类或其它哺乳动物的细胞融合经转化的二倍体啮齿类细胞受者，以形成人类-啮齿类或其它哺乳动物-啮齿类杂交细胞。通过选择第一人类或其它哺乳动物染色体和啮齿类染色体各自的标记来选择融合后杂交细胞，以形成在没有选择人类或其它哺乳动物染色体的情况中稳定维持一或多个人类或其它哺乳动物染色体的细胞群体。在细胞群体中检测对于第二人类或其它哺乳动物染色体而言是单倍体的细胞，该第二人类或其它哺乳动物染色体不同于该第一人类或其它哺乳动物染色体，而且没有选择。

本发明还提供了啮齿类-人类或啮齿类-其它哺乳动物杂交细胞群体，其中，在100个细胞中至少有1个细胞，在其中至少2个人类或其它哺乳动物常染色体的每种同系物以单倍体形式存在。

本发明由此通过提供对于一种或多种目的基因而言是单倍体的杂交细胞用于分析而为本领域提供了可用于提高多种诊断和分析方法的灵敏度和效力的方法。杂交细胞的人类或其它哺乳动物染色体成分是稳定的且一致的。

                    图的简述

图1：用于生成杂交细胞的策略。使受者小鼠细胞系E2融合人类淋巴细胞，随后用HAT+遗传霉素(分别杀死未融合的E2细胞和淋巴细胞)选择克隆。所有克隆包含负责在HAT中生长的人类X染色体。测定克隆的基因型以确定保留了哪个人类染色体。标有“A”和“B”的染色体表示代表性人类染色体的两种同系物。图中指出了所分析6种染色体同系物的二者皆未保留、二者都保留、或保留二者任一的克隆所占平均比例(见正文)。对保留待测基因的一个等位基因的克隆的核酸进行突变分析。