[发明专利]用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物

权利要求书

1、一种用于扩增与靶多核苷酸序列互补的多核苷酸序列的方法，该方法包括：

(a)使包括靶序列的单链DNA模板与一组合引物杂交，所述组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；

(b)相对于组合引物与模板的杂交，将包括终止多核苷酸序列的多核苷酸与模板的5’区域杂交；

(c)用DNA聚合酶延伸组合引物；

(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，所述酶从DNA/RNA杂交体裂解RNA，以便另一组合引物可与模板杂交并通过链置换重复引物的延伸，

由此产生靶序列的互补序列的多个拷贝。

2、一种用于扩增靶多核苷酸序列的方法，该方法包括：

(a)使包括靶序列的单链DNA模板与一组合引物杂交，所述组合引物包括RNA部分和3’DNA部分；

(b)相对于组合引物与模板的杂交，将包括终止多核苷酸序列的多核苷酸与模板的5’区域杂交；

(c)用DNA聚合酶延伸组合引物；

(d)用一种酶裂解退火组合引物的RNA部分，所述酶从DNA/RNA杂交体裂解RNA，以便另一组合引物可与模板杂交并通过链置换重复引物的延伸，从而产生置换引物延伸产物；

(e)使包括前启动子的多核苷酸与一区域进行杂交，该区域在可发生由RNA聚合酶进行的转录的条件下杂交到置换引物延伸产物上，以便生成包括与置换引物延伸产物互补的序列的RNA转录物，

由此产生靶序列的多个拷贝。

3、权利要求1或2的方法，其特征在于组合引物的RNA部分是相对于3’DNA部分的5’部分。

4、权利要求3的方法，其特征在于5’RNA部分邻近3’DNA部分。

5、权利要求1或2的方法，其特征在于采用多个组合引物。

6、权利要求1或2的方法，其特征在于包括终止序列的多核苷酸是模板切换寡核苷酸(TSO)。

7、权利要求6的方法，其特征在于TSO在与模板杂交的区域上包括一修饰，其中在一系列给定的条件下，与没有修饰的TSO相比，该TSO更紧密地结合到该区域上。

8、权利要求1或2的方法，其特征在于包括终止序列的多核苷酸是一封闭序列。

9、权利要求8的方法，其特征在于该封闭序列在与模板杂交的区域上包括一修饰，其中在一系列给定的条件下，与没有修饰的封闭序列相比，该封闭序列更紧密地结合到该区域上。

10、权利要求1或2的方法，其特征在于裂解RNA的酶是RNase H。

11、权利要求2的方法，其特征在于包括前启动子和杂交到置换引物延伸产物上的区域的多核苷酸是模板切换寡核苷酸(TSO)。

12、权利要求2的方法，其特征在于含有前启动子的多核苷酸在3’端包括一个区域，该区域杂交到置换引物延伸产物上，由此置换引物延伸产物的DNA聚合酶的延伸产生一个用于转录的双链启动子。

13、权利要求12的方法，其特征在于包括前启动子的多核苷酸是前启动子模板寡核苷酸(PTO)。

14、权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)和(b)的进行顺序可以互换。

15、权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)和(b)可同时进行。

16、权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)、(b)和(c)可同时进行。

17、权利要求1或2的方法，其特征在于步骤(a)和(b)可在步骤(c)之前进行。

18、权利要求1或2的方法，其特征在于所有步骤可同时进行。