[发明专利]利用小单孢菌将密实菌素羟基化为普伐他汀

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备普伐他汀的新微生物方法。更具体地是，本发明涉及一种利用微生物由通式(II)的化合物制备式(I)的普伐他汀的微生物方法：

其中R代表一种碱金属或铵离子，其中所述微生物是一种属于小单孢菌属(Micromonospora)的原核生物，其能够在6β-位置上羟基化通式(II)的化合物。

背景技术

高胆固醇血症被认为是动脉粥样硬化疾病，尤其是冠心病的一种主要危险因素。在过去的二十年中，已经对作为胆固醇生物合成过程中的主要限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶EC.1.1.1.34)进行了广泛的研究。通过不同真菌菌种的选择菌株生物合成的美维诺林(Mevinolin)及其相关化合物被发现是该酶的竞争性抑制剂[Endo，A等，抗生素杂志(J.Antibiotics)29，1346-1348(1976)；Endo，A等，FEBS Lett.72，323-326(1976)；Kuo，C.H.等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)48，1991-1998(1983)]。

普伐他汀也是HMG-CoA还原酶抑制剂家族中的一员。首先，在对密实菌素的代谢进行研究的过程中[Arai，M.等，Sankyo KenkyushoNempo，40，1-38(1988)]，发现普伐他汀是狗体内一种密实菌素的次要尿代谢物(Tanaka，M.等，未公开)。

作为密实菌素的羟基化产物的普伐他汀的主要特征是它的组织选择性。该药物强烈地抑制甾醇在肝内和肠内的合成，但在其它器官，抑制作用较弱。有利的是普伐他汀的毒性低于其它HMG-CoA还原酶抑制剂的毒性。

据报道通过属于多种不同真菌属的种的几种菌株，以及通过属于诺卡氏菌属(Nocardia)，马杜拉放线菌属(Actinomadura)和链霉菌属(Streptomyces)的放线菌种的菌株，尤其是玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)和嗜碳链霉菌(Streptomycescarbophilus)，可在不同程度上实现密实菌素的微生物羟基化(美国专利5179013，4448979，4346227，4537859，及日本专利58010572)。

利用真菌由密实菌素制备普伐他汀的过程中存在的问题是这些生物体通常耐受不了液体培养基中较高的密实菌素浓度，这大概是由于密实菌素具有抗真菌活性[Serizawa，N.等，抗生素杂志36，887-891(1983)]。在嗜碳链霉菌中，已表明细胞色素P450系统为密实菌素被羟基化为普伐他汀所必需的[Matsuoka，T.等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)184，707-713(1989)]。遗传改进这种酶羟基化能力的困难在于该酶是一种蛋白质复合体而不是单个蛋白质。

本发明的公开

我们的研究集中在寻找一种放线菌菌株，该菌株能由酸式密实菌素的盐产生普伐他汀，该菌株在生物转化中采用的底物浓度以及转化率比上述专利说明书中公开的那些高。

在筛选过程中，筛选包括了大约6000个放线菌菌株，大多是我们自己的分离物，但也包括来源于国际菌株保藏中心的可靠菌株，选出五个链霉菌菌株和五个小单孢菌菌株用于进一步的研究，因为它们被证明具有将酸式密实菌素的钠盐羟基化为普伐他汀的能力。我们实验室已在种的水平上对这十个放线菌菌株中的八个菌株进行了分类学鉴定，这十个放线菌菌株是：

紫色链霉菌(Streptomyces violaceus)(根据Kmpfer等，1991)，菌株号1/43；

娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)(Berger等，1949；Waksman和Lechevalier，1953)，菌株号1/41；

拒霉素链霉菌(Streptomyces resistomycificus)(Lindenbein等，1952)，菌株号1/44；

链霉菌属的种(Streptomyces sp.)，菌株号1/28；

羊毛链霉菌(Streptomyces lanatus)(Frommer，1959)，菌株号1/16；

小单孢菌属(Micromonospora sp.)，菌株号IDR-P₃；