[发明专利]杀虫融合物

说明书

技术领域

本发明涉及具有结合与毒性部分的新型杀虫融合多肽。其还涉及产生和使用此类多肽的方法和材料，以及分析多肽毒性的分析方法和试剂盒。

现有技术

本领域公知源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)的毒素具有杀虫特性。自然状态下，前毒素大分子(130-160kDa)溶于昆虫中肠的碱性环境中。溶解的毒素然后发生蛋白水解，裂解为更小的片段(30-80kDa)。在δ内毒素晶体溶解和活化后，该毒素与特定的中肠细胞表面受体相结互作用，在膜内形成孔洞。细胞的离子平衡受到破坏，细胞裂解。

Bt毒素引起使用者特别注意的地方是其宿主范围、低浓度毒性，以及使目的昆虫产生耐药性的能力。

已报道了许多研究该诸多问题、意欲改善天然毒素的一或多方面的实验。

这样一般认为顶膜上特定受体的存在对于Bt毒素的特异性起重要作用(1)。在这种情况下，毒素潜力可依赖于受体丰度及其与该蛋白的亲和力，以及该毒素形成孔洞的能力。杀虫晶体蛋白CryIA(a)和CryIA(c)有82％同源性，但后者对烟芽夜蛾(heliothisvirescens)和粉纹夜蛾(trichoplusiani)的杀虫活性比CryIA(a)高10倍(4)。这两种基因之间的同源扫描和相互重组表明，CryIA(c)的335-450氨基酸与抗T.ni的活性有关，而同一毒素的335-615氨基酸是完全变成H.virescens特异性所必需的(4)。

总体而言，杀虫蛋白的特异性是几种功能的结果，包括昆虫中肠蛋白酶的蛋白水解过程、受体结合和/或细胞裂解功能(4)。鳞翅类特异性的杀虫晶体蛋白的末端缺失结果表明5’端至第10密码子或3’端第645密码子缺失不会使毒性消失(5)。

通过点定向突变，Cry毒素暂定为含三个功能结构域。结构域I与毒素插入到膜内有关并影响离子通道的功能，结构域II与受体结合和插入到膜内有关，结构域III与离子通道功能、受体结合以及插入到膜内有关(6)。

在烟草天蛾幼虫(manduca sexta)和甘蓝蝴蝶(大菜粉蝶(Pierisbrassicae))的刷状缘膜囊泡上进行两种Btδ内毒素Bt2(源自苏云金芽孢杆菌柏林那亚种(B.thuringiensis berliner)的130kDa重组晶体蛋白)和Bt4412(源自苏云金芽孢杆菌苏云金亚种(B.thuringiensis thuringiensis)的136kDa晶体蛋白)的结合研究(12)。Bt2活性蛋白(60kDa)结合并杀伤两种昆虫而Bt4412活性蛋白仅对烟草天蛾幼虫有强毒性(12)。该研究表明大菜粉蝶与Bt2和Bt4412毒素具有两种不同的结合位点，因为两种蛋白几乎并不竞争彼此的结合位点(12)。

自敏感烟草天蛾幼虫的中肠上皮细胞克隆得到CryIA(b)毒素的受体(13)。据测定该210kDa的膜糖蛋白受体与钙粘蛋白蛋白质超家族具有30-60％相似性，和20-40％同一性。钙粘蛋白是膜糖蛋白，据信介导钙依赖的细胞积聚和分类(13)。该受体的确切功能尚未得知。但有可能参与膜转运，一种与钙粘蛋白样人肠肽转运蛋白的功能相类似的功能，后者引导肽类抗生素透过沿小肠排列的上皮细胞(13)。认为苏云金芽孢杆菌毒素主要作用于敏感昆虫的中肠上皮细胞(13)。