[发明专利]革兰阴性菌的肽聚糖结合脂蛋白的脂化形式的制备

说明书

                           发明领域

本发明涉及革兰阴性菌的肽聚糖结合蛋白的脂化(lipidated)形式的表达以及该重组脂化蛋白在抗原性组合物中的用途。

                           发明背景

革兰阴性菌的细胞壁含有称为肽聚糖的交联物质。许多革兰阴性菌产生与肽聚糖共价连接的蛋白质。这样的蛋白质称为肽聚糖结合脂蛋白(PAL)。PAL在许多革兰阴性菌中以tol基因座的一部分存在，这些革兰阴性菌包括侵肺军团菌(书目1)、大肠杆菌(2)、杜氏嗜血菌(3)、空肠弯曲杆菌(4)、恶臭假单胞菌(5)、流产布鲁氏菌(6)、绿脓杆菌、产气克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、普通变形菌、鼠伤寒沙门氏菌(7)、大叶性肺炎放线杆菌(8)、幽门螺杆菌(9)、肺炎衣原体(10)和砂眼衣原体(11)。

其它含PAL的细菌是流感嗜血菌(H.influenzae)。流感嗜血菌分成两组。通过荚膜与参比抗血清的血清学反应，对具有已知荚膜的那些菌株进行分型。已经鉴定到a-f型。不能与任何参比抗血清反应的菌株称为非典型菌株。

b型流感嗜血菌(Hib)是美国新生儿脑膜炎和其它侵入性感染的最常见的病因(12)。儿童脑膜炎主要发病于1-5岁之间。由Hib引起的那些脑膜炎病例中有60％见于2岁以下的儿童(12)。

非典型的流感嗜血菌(NTHi)是一种革兰阴性菌，它引起许多疾病，包括成人急性发热性气管支气管炎、肺炎、菌血症、脑膜炎和产后败血症。已经报道NTHi引起少年儿童中所见所有中耳炎病例的20-40％(14，15，16)。儿童会多次受相同细菌感染，因为对感染不能产生长期持续的免疫力。目前针对中耳炎的慢性或重复发病的治疗包括抗生素给药和插管引流内耳。NTHi菌株还被暗示是副鼻窦炎的主要病因(17)。另外NTHi可引起新生儿败血症。

目前的基于荚膜的抗原性组合物疫苗对NTHi无效。这些细菌的表面显示出有很高的抗原变异，主要的外膜蛋白P1和P2尤其多样(18，19)。据报道，人体中血清杀菌抗体的存在与对敏感型NTHi菌株引起的中耳炎的保护作用相关(20)。

掺入抗原性组合物的针对NTHi的候选物(疫苗)应当在氨基酸水平上是高度保守的，是外露的(尤其是外膜蛋白)，能引发杀菌抗体，应存在于所有分离的细菌中。以前的研究已经表明，NTHi的P6(也称为PBOMP-1和HiPAL)(21)蛋白符合这些标准。其纯化的天然蛋白已经显示能引发杀菌抗体(22，23，24，25)，并且在抗原上是保守的(22，23，26，27)。

评价P6基因的遗传序列，结果表明它在耳NTHi分离菌中是高度保守的，因此其蛋白质序列也是高度保守的。天然的P6是一种脂蛋白，更具体地说是PAL，其在氨基端半胱氨酸处被脂质修饰。该蛋白在流感嗜血菌中的量较少(小于外膜总蛋白的1％)，从而使得很难从天然细菌中纯化得到有用的量。因此，为了开发出作为抗原性组合物的组分，需要重组版的P6。

有几个实验室没有能在大肠杆菌中大量表达脂化的rP6(28，29)。结果，在大肠杆菌中表达P6的初始重组构建物只能表达非脂化的蛋白质。这些研究小组报道说，尽管从流感嗜血菌纯化获得的脂化的P6蛋白比从大肠杆菌中纯化得到的非脂化rP6更具免疫原性，但是却很难工程改造获得能表达脂化P6的DNA载体(28，29)；即，不比流感嗜血菌表达的低水平天然P6更好。

上述表达脂化rP6的尝试依靠未受到紧密转录调控的启动子，例如trc，taq，lac和P_L-C1857。其理论是，这种稍有漏洞的转录对大肠杆菌产生了细微的作用，使得脂化蛋白的表达水平较低。试验证据暗示，信号肽酶II将脂质加到该蛋白N端的能力并不是加工后的P6低产率的原因(数据未显示)。

尽管流感嗜血菌的P6蛋白是加入抗原性组合物中用来抵抗嗜血菌疾病的主要候选物(20，23，24，25，30，31)，但是从流感嗜血菌获得的量较少使得必须对该蛋白进行重组表达。以前表达有用量的脂化P6蛋白的尝试没有成功(28，29)。因此，研究者致力于非脂化P6的多种形式的表达和纯化。

非脂化rP6产生的抗体应答有生物学功能，能保护年幼大鼠免患脑膜炎(28)，并引发杀菌抗体(28，29)，但是其量低于脂化的天然P6所引发的量(28)。

因此，需要构建一种表达革兰阴性菌的脂化PAL的宿主细胞表达载体系统。具体地说，需要构建一种表达脂化rP6的宿主细胞表达载体系统，然后可将脂化的rP6加入抗流感嗜血菌的抗原性组合物中。