[发明专利]缀合物及其制备方法和用于跨生物膜转运分子的用途

说明书

本发明提供缀合物、它们的制备方法和这些缀合物用于跨生物膜转运低分子量化合物与大分子的用途，特别是转运分子进入细胞。本发明还提供药物与诊断助剂和试验试剂盒，其中含有或使用这些缀合物。

靶在细胞内的分子的治疗应用的限制性因素经常是它们的细胞摄取是不理想的，细胞内分布是不适宜的。典型的实例是诸如核酸等大分子，它们以序列特异性方式与细胞DNA或RNA结合，因而抑制基因表达。反义寡核苷酸是短的单链核酸，它们经由Watson-Crick碱基对与互补mRNA结合，抑制后者转译为相应的蛋白质。形成三股螺旋的寡核苷酸经由所谓的“Hoogsteen碱基配对”与DNA双螺旋深沟结合，形成三螺旋，因而以序列特异性方式抑制基因转录。其他细胞内作用性寡核苷酸例如所谓的“圈套(decoy)”寡核苷酸，它们模拟转录因子的结合区域。通过圈套寡核苷酸的处理，能够以序列特异性方式拦截某些转录因子，因而抑制转录的活化作用。另一组细胞内作用性寡核苷酸是chimeraplast，用于定向基因校正(Cole-Strauss等《科学》273(1996)1386-1389)。关于这种基因校正，chimeraplast寡核苷酸摄取进入细胞也是必需的。其他细胞内作用性核酸的实例是与细胞酶、特别是端粒酶发生相互作用的那些(Norton等《天然生物技术》(1996)14，615)。在基因疗法的意义上，另一类核酸、优选为双链DNA，能够编码某些细胞内表达的蛋白质。

例如，寡核苷酸体外摄取进入细胞是相对低效的过程，例如简单地向细胞培养基中加入寡核苷酸，这是因为实际上仅有一小部分所加入的寡核苷酸被摄入细胞。摄取过程花费很多小时，在多数情况下，仅在8至16小时后达到平台期。推定寡核苷酸是在胞饮作用样过程中被摄入的。不过，经由胞饮作用摄取所面临的一个普遍问题是大比例的寡核苷酸不是游离于细胞质中，而是被包封在某些细胞结构中，即溶酶体和内体。在荧光标记的寡核苷酸的情况下，通过荧光显微法的确能够观察到这种定位分布。由于这种囊性定位作用，实际上可用于与mRNA杂交的游离寡核苷酸浓度大为减少。而且，根据细胞类型和现有条件，首先仅有某一部分的细胞摄入寡核苷酸。因此，关于反义寡核苷酸的有效利用，普遍采用与透入增强剂，例如阳离子脂质的混合物(Bennett等《分子药理学》41(1992)1023)。

本发明的目的是提高分子、特别是大分子的细胞摄取，例如寡核苷酸。

寡核苷酸细胞摄取的检查普遍是利用放射性标记或荧光标记的寡核苷酸进行的。寡核苷酸的荧光标记例如是通过寡核苷酸的氨基官能与异硫氰酸荧光素(FITC)的反应进行的。荧光素例如可以经由商业上可得到的荧光素类固相载体而引入到寡核苷酸的3’末端，或者经由商业上可得到的荧光素亚磷酸化试剂而引入到5’末端。在所有情况下，由于羧酸官能，与寡核苷酸结合的荧光素都是带负电的强荧光性结构单元。

与荧光素相反，荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，FDA)是一种中性活体染剂，它仅在两个酯基的除去和内酯环的打开之后才转化为荧光性荧光素，但是内酯形式不是荧光性的。

已知FDA(以下也称“F3”)作为一种中性、非荧光性分子，经由被动扩散而被活体细胞摄入，被酯酶细胞内裂解得到荧光性荧光素(Breeuwer等《应用环境微生物学》(1995)61，1614；Maeda等《细胞结构与功能》(1982)7，177)。迄今，所述唯一FDA衍生物是含有胺反应性基团的那些，例如异硫氰酸酯；这些FDA衍生物用于染色细胞内蛋白质或细胞组分。FDA与其他分子的缀合物迄今尚未被描述过；相应地，FDA-标记的寡核苷酸(FDA与寡核苷酸的缀合物)同样迄今尚未被描述过。

在细胞质中，FDA被酯酶裂解；相应地，有可能通过寡核苷酸的FDA标记测定“游离”寡核苷酸的比例，也就是有多少寡核苷酸存在于细胞质中——可用于杂交——关于存在于囊泡中的寡核苷酸(“被捕获的”寡核苷酸)——相应地不可用于杂交的寡核苷酸。由于寡核苷酸中的负电荷总数高和FDA-标记与荧光素-标记的寡核苷酸的区别仅在于一个净电荷这一事实，预期FDA-标记与荧光素-标记的寡核苷酸将表现非常相似的细胞摄取和分布。