[发明专利]7－氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7－ADCA)的制备方法

说明书

发明领域

本发明涉及利用经转化的金黄顶孢霉属(Acremoniumchrysogenum)菌株发酵生产7-ADCA或其中间产物青霉素N或去乙酰氧基头孢菌素C。现有技术描述

头孢菌素是一类具有重要治疗意义的抗生素，工业上用A.chrysogenum发酵制备或者将青霉素的四氢噻唑环化学扩环形成双氢噻嗪环制备。在β-内酰胺和双氢噻嗪环的各个位置上插入侧链可以合成大量具有更强抗生能力或药物动力学性质改善的头孢菌素。近些年来，对于制备这类半合成抗生素已经表现出越来越浓厚的兴趣，并在它们的制备工艺和方法上产生了许多优化和创新。

7-氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)是一种用于制备3-位功能化缺失的特殊头孢菌素中使用的底物。由于3-位功能化缺失，通常7-ADCA是从发酵生成的青霉素的四氢噻唑环扩环合成，而其他头孢菌素化合物是从发酵得到的天然头孢菌素开始制备。通常，7-ADCA是从青霉素G或V经过4-5步化学反应把青霉素的五元环扩展成头孢菌素的六元环生成的。和生物学方法相比较，所述方法象一些化学方法一样有很多缺点：即该方法是一种多步骤的复杂过程，需要应用具毒性和昂贵的化学试剂，需要应用有害环境的有机溶剂，在合成过程中还产生需要复杂纯化系统的副产品和杂质。作为化学方法的替代，提出很多利用微生物发酵和生物转化生产7-ADCA的策略。这涉及到和二十世纪八十年代形成的利用酶水解青霉素G和V生产6-氨基青霉素酸(6-APA)一样的方法，或者与二十世纪九十年代提出的利用酶水解头孢菌素C的D-(α)-氨基己二酸侧链一样的策略。在后一个策略中，反应由D-氨基酸氧化酶(DAO)和戊二酰-7-ACA酰基转移酶催化，所述D-氨基酸氧化酶参与将氨基己二酸侧链转化为戊二酸的转氨作用，戊二酰-7-ACA酰基转移酶将戊二酸侧链水解生成7-ACA。

去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)是A.chrysogenum菌株的过表达产物，它是7-ADCA的直接前体，但是上述微生物中存在双功酶——去乙酰氧基头孢菌素C合酶(DAOCS或扩环酶)导致产物复杂化，该酶使四氢噻唑环扩环并水解生成去乙酰基头孢菌素C(DAC)。与放线菌中发生的问题一样，由于存在能把头孢菌素分子上的7位甲氧基化形成头孢霉素的酶，妨碍了菌株过表达产生DAOC。大部分利用酶法或者发酵处理获得7-ADCA的尝试都集中在应用具有DAOCS活性的酶上，该酶催化青霉素中的五元四氢噻唑环扩展到头孢菌素中的六元双氢噻嗪环。

理论上说，直接由发酵和(或)酶水解青霉素G或V生成的6-APA能够用DAOCS扩环形成7-ACA，可惜目前为止没有一个DAOCS能够以6-APA为底物，因此不能够使四氢噻唑环扩环。另一方面，在体内或者体外，利用DAOCS形成相应的头孢菌素G或V，再酶水解生成7-ADCA从而扩展青霉素G或V的可能性已经有人阐述了。无论如何，由于DAOCS底物的高度特异性，这些系统的效率和产率远远达不到工业化的要求。

最近有报告表明可以利用表达了带棒状链霉菌的DAOCS的重组黄青霉菌(P.chrysogenum)菌株生产己二酰-7-ADCA。在发酵中附加己二酸(分别代替在制备青霉素G或V中的苯乙酸或苯氧乙酸)能够提高己二酰基-6-APA的产生，该分子是一种在体内被DAOCS识别从而将四氢噻唑环扩环生成己二酰-7-ADCA的分子。然后己二酰-7-ADCA从发酵培养基中与其它成分(特别是己二酰基-6-APA)分离纯化，并且用己二酰基转移酶水解生成7-ADCA。虽然上述生产和酶扩环以及侧链的水解过程都有很高的效率，但它存在下列基本缺陷：(I)必须添加昂贵的侧链，比如说己二酸，和(II)产物是己二酰基-6-APA和己二酰-7-ADCA的混合物，由于它们具有相似的结构和对己二酰基转移酶的相似酶水解活性，必须预先分离，这增加了工艺复杂性。