[发明专利]用酵母生产具有绵羊、牛、山羊乳汁等凝固和蛋白水解活性的植物来源的天冬氨酸蛋白酶

说明书

介绍

使用酵母表达系统已成为以工业规模生产大量不同类型化合物的一种途径。关于具有工业应用的植物来源的天冬氨酸蛋白酶的生产，尚没有关于以工业规模用于生产的酵母表达的任何报导。

如下所述，本发明专利的目的涉及构建质粒、转化酵母菌株和生产植物来源的天冬氨酸蛋白酶。

质粒的构建、酵母菌株的转化和植物来源的蛋白酶的生产

将编码基因CYPRO11插入植物来源的蛋白酶中构成控制植物来源的天冬氨酸酶的酵母表达的实验模型。

使用2μ型多拷贝质粒和具有少量拷贝的着丝粒质粒构建两种大肠杆菌-酵母表达系统载体。所用基因的选择是缺损亮氨酸的(LEU2)。表达盒含有显影剂G7和来自异源基因上游的四种不同前导序列。异源基因的转录利用PGK1终止子终止。

从所测试的不同前导序列(天然原序列、preSUC2-proCYPRO11、preMFα-proCYPRO11和preproMFα)，我们推断preMFα-proCYPRO11是用于生产植物来源的天冬氨酸蛋白酶的最佳前导序列，不论相当于植物来源的模型蛋白的环丙辛(cyprosins)由CYPRO11基因编码，还是由另一种商业上感兴趣的植物来源的酸性天冬氨酸蛋白酶编码。

MFα酵母前序列足以促使天冬氨酸蛋白酶分泌到培养基中，而不需要使用基因的原序列。天然原序列是活性蛋白质生产必需的。

使用具有少量拷贝的着丝粒质粒得到了比2μ型多拷贝质粒更好的结果。

测试不同的酵母菌株，包括酿酒酵母BJ1991(MATαleu2 trpl ura3-52prbl-1122pep4-3)，BJ2168(MATαleu2 trpl ura3-52 prcl-1122pep4-3)，MT302/1c-a(arg5-6 leu2-12 his3-11 his3-15 peb4-3 ade1)，W303-1^a(MATαleu2-3，112ura3-1 trpl-1 his3-11，15 ade2-1 can1-100 GALSUC2)。

将这些菌株保持在含有1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨、2％葡萄糖和1.5％琼脂的YPD琼脂板上。

转化酵母在添加了适合除了亮氨酸以外的每种菌株的营养缺陷需要的氨基酸的SD培养基(没有氨基酸的0.67％酵母氮基，DIFCO，2％(w/v)葡萄糖)中生长。

收集培养物并用无菌蒸馏水洗涤一次。将细胞再悬浮于YPGal培养基(1％酵母提取物、2％细菌蛋白胨、4％半乳糖)并用于以A₆₀₀＝0.2的密度接种相同培养基。培养物在相同的培养条件下培养直到它们的密度达到A₆₀₀＝2、6或10。

在所测试的酵母菌株中，蛋白酶缺损株BJ1991在培养基中产生并分泌了最大量的具有相当强的乳汁凝固和蛋白水解活性的天冬氨酸蛋白酶。蛋白水解酶的分泌因此取决于培养物的生长。在YPGal培养基生长的稳定期(A₆₀₀＝10)里获得了具有最高程度的凝固和蛋白水解活性的重组蛋白酶。在指数期(A₆₀₀＝2)里，酵母细胞分泌具有高分子量的失活重组蛋白酶。它被认为是蛋白酶的未加工形式，其中称为特异性植物插入片段的植物来源的酸性天冬氨酸蛋白酶基因的特异性区域未被除去。

由酵母分泌的重组蛋白酶的最大亚单位是在可能糖基化的唯一位点上糖基化的，且含有相当大量的甘露糖型聚糖链。

多克隆抗体的制备

用于生产具有相当强凝固和蛋白水解活性的植物来源的酸性天冬氨酸蛋白酶的多克隆抗体的总蛋白提取物从刺菜蓟的干燥花通过在乳钵中浸渍于液氮中并用50mM Tris Hcl缓冲液，pH8.3提取得到(Heimgartner等，1990)。蛋白质使用100μg总蛋白提取物/孔在12％SDS-PAGE中分馏。凝胶用0.02％考马斯蓝的蒸馏水溶液染色。将与植物酶的最大亚单位相对应的条带(SDS-PAGE凝胶中的31-32.5kDa)分离并将每孔中的内容物送到EUROGENTEC(比利时)用于生产抗体。

植物来源的蛋白酶的分离和蛋白质印迹分析

使用生长至密度为A₆₀₀＝2、6或10的30ml酵母细胞从细胞提取物分离重组植物来源蛋白酶。收集后，细胞用蒸馏水洗涤，再悬浮于500μl缓冲液并通过用玻璃球摇动使它们破裂。

从培养基分离重组蛋白酶在收集了培养基并通过超速离心使其浓缩约10倍后进行。