[发明专利]血管内皮细胞生长因子变体及其应用

说明书

                      发明领域

本发明涉及血管内皮细胞生长因子(VEGF)变体，制备所述变体的方法，使用所述变体的方法，组合物和测定法。更具体地说，本发明涉及对VEGF受体，KDR和FLT-1具有不同于天然VEGF的结合亲和力的VEGF变体。

                      发明背景

血管的两种主要细胞成分是内皮和平滑肌细胞。内皮细胞形成所有血管内表面的衬里并构成血液和组织之间的非血栓形成性界面。另外，内皮细胞是形成新的毛细血管和血管的重要成分。因此，内皮细胞在与肿瘤生长和转移以及各种非致瘤性疾病或紊乱相关的血管发生或新血管形成期间增生。

已报道各种天然存在的多肽诱导内皮细胞的增生。这些多肽中有碱性和酸性成纤维细胞生长因子(FGF)，Burgess和Maciag，生物化学年鉴，58：575(1989)，血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，Ishikawa等，自然，338：557(1989)和血管内皮生长因子(VEGF)，Leung等，科学，246：1306(1989)；Ferrara和Henzel，生物化学和生物物理研究通讯，161：851(1989)；Tischer等，生物化学和生物物理研究通讯，165：1198(1989)；Farrara等，PCT专利公开号WO90/13649(1990年11月15日公开)。

VEGF首先在牛垂体滤泡或滤泡星形细胞的条件培养基中证实。生化分析表明牛VEGF是二聚体蛋白质，具有大约45,000道尔顿的表观分子量和具有对血管内皮细胞的表观促细胞分裂特异性。使用以该蛋白质氨基末端氨基酸序列为基础的寡核苷酸作杂交探针经过筛选从该细胞制备的cDNA文库分离了编码牛VEGF的DNA。

使用牛VEGF cDNA作杂交探针经过首次筛选从人细胞制备的cDNA文库获得了人VEGF。由此鉴定的一个cDNA编码与牛VEGF具有超过95％同源性的165个氨基酸的蛋白质；该165个氨基酸的蛋白质一般称为人VEGF(hVEGF)或VEGF165。经过在哺乳动物宿主细胞中表达人VEGF cDNA证实了人VEGF的促细胞分裂活性。用人VEGF eDNA转染的细胞为条件的培养基可促进毛细血管内皮细胞的增生，而对照细胞不能。[见Leung等，科学，246：1306(1989)]。

尽管可从天然来源分离和纯化血管内皮细胞生长因子用于随后的治疗用途，但回收VEGF时在滤泡细胞中相对低的该蛋白质浓度和在劳力和花费方面的高成本证实在商业上不可行。因此，进行了进一步的努力以便经过重组DNA技术来克隆和表达VEGF。[参见，例如，实验室调查，72：615(1995)，并在此引用该参考文献]。

已报道VEGF用于治疗在不存在过度组织生长的情况下，对血管内皮细胞的选择性作用重要的病情，例如，糖尿病型溃疡和由诸如皮下伤口的创伤引起的血管损伤。VEGF，即血管(动脉和静脉)内皮细胞生长因子可恢复损伤的细胞(称为血管发生的过程)和可刺激新血管形成(称为血管形成的过程)。[参见，例如，Ferrara等，内分泌学回顾，18：4-25(1997)]。

VEGF在各种组织中由于可选择的RNA剪接导致以多种同型二聚体形式表达(每个单体121，165，189和206个氨基酸)。VEGF₁₂₁是一种不结合肝素的可溶性促细胞分裂剂；更长的VEGF形式以逐渐更高的亲和力结合肝素。VEGF的肝素结合形式可被纤溶酶在羧基末端裂解释放出VEGF的可扩散形式。纤溶酶裂解后鉴定的羧基末端肽的氨基酸测序为Arg110-Ala111。氨基末端“核心”蛋白，即作为同型二聚体分离的VEGF(1-110)与完整的VEGF₁₆₅同型二聚体相比以相似的亲和力结合单克隆中和抗体(例如称为4.6.1和3.2E3.1.1的抗体)和FLT-1以及KDR受体的可溶性形式。