[发明专利]诊断传染性海绵状脑病的方法

说明书

本发明涉及一种诊断传染性海绵状脑病的方法和一种使用朊病毒蛋白和层粘连蛋白受体的特异性抗体的诊断性检验试剂盒。本发明还涉及所述方法或检验试剂盒在诊断传染性海绵状脑病中的用途。

250年以前，人们发现了绵羊患的一种疾病，这种疾病伴随着精神紧张、瘙痒病、共济失调，最终瘫痪和死亡。这种疾病在使用英语的国家被称为“瘙痒病”(因为动物为了止痒而在木桩和树干上摩擦)，在法国被称为“latremblante”而在德国被称为“Traberkrankheit”。这些名称反映了其症状的多样性。“瘙痒病”被作为一组不仅影响动物而且影响人类的疾病：传染性海绵状脑病(＝TSE)的原型来研究。TSE是能攻击多种哺乳动物的致命的神经系统疾病。

牛海绵状脑病(BSE)是牛所患的一种神经系统疾病，它与绵羊和山羊的瘙痒病和人类的克-雅氏病有关。一种宿主编码的功能未知的膜相关糖蛋白，就是所谓的朊病毒蛋白PrP在这种疾病的发病机制中起关键作用。这种细胞同工型不仅能在神经元细胞上有非常强的表达，而且在非神经元细胞上也可以以不定的频率测到。这种膜蛋白对特异性酶(蛋白酶)的消化敏感(PrP-sen)。然而，可溶性的、恶性形式的PrP(PrP-res)是抗蛋白酶的，它在感染BSE的动物大脑中蓄积从而形成淀粉样斑块。这种PrP-res形式仅与所有传染性海绵状脑病，包括BSE有关，它可以从感染传染性海绵状脑病/BSE的脑组织中提取出来。

在早期，人们推测这种瘙痒病/BSE病原体的非同寻常的特征是：它仅由核酸或蛋白组成或既不含核酸也不含蛋白，而是一种多糖或膜片段。目前争论最多的是“仅含蛋白”的假说和病毒/朊病毒假说：“仅含蛋白”的假说是基于不包含核酸并能自我复制的感染性PrP-res。据推测PrP-res可结合PrP-sen，从而使其转化为恶性同工型。这种恶性同工型的构象是以β-折叠结构为特征的，然而其细胞同工型中却以α-螺旋占优势。病毒/朊病毒假说是基于由病毒核酸(可能为RNA)组成的感染因子以及作为该病毒基因组的外壳的朊病毒蛋白。朊病毒外壳的宿主起源可以解释为什么不发生免疫反应和炎症反应。核酸的存在可以进一步解释迄今为止被描述过的20种不同的瘙痒病鼠毒株。

细胞同工型PrP-sen在两个天冬酰胺位点被糖基化，它具有33-35000Da的分子量，它通过磷脂酰肌醇糖脂被固定在胞质膜的外表面，该糖脂在其羧基端氨基酸处被固定。PrP-sen的最高表达率可在大脑中检测到，但其基因也在非神经元性胚胎组织和成人组织中表达。这种蛋白的生物功能至今仍不清楚。可以设想，PrP可能是一种神经营养性(neurotrophic)分化因子的受体。该蛋白还与睡眠/苏醒节律有关。但是，PrP也可能是亲神经(neurotrophic)病毒的受体。

这种蛋白的正常细胞同工型能被蛋白酶完全降解(PrP-sen)。相反，恶性异构型(PrP-res)被蛋白酶降解为27-30000Da的片段，这种片段仍具有完全的感染力(PrP-res)。PrP-res缺乏成熟PrP-sen蛋白最初的67个氨基酸。转录后加工与PrP-sen到PrP-res的转化有关，而且有人怀疑PrP-sen和PrP-res之间唯一的不同在三维结构中。在该蛋白的正常和非正常形式之间，没有显示出任何生物化学方面的不同。这也解释了为什么这两种同工型没有显示出任何抗原性的不同。此外，PrP-sen和PrP-res具有共同的氨基酸序列。PrP是由染色体基因的单拷贝编码的，其在哺乳动物中高度保守。完整PrP编码序列包含在单一的外显子中。    

与表达于表面的PrP-sen比较，PrP-res在胞浆滤泡中累积，这些滤泡中大多数是次级溶酶体。

TSE疾病以较长潜伏期为其特征，潜伏期间观察不到临床症状，然后是短暂的临床期，其总是导致死亡。

因为自然感染的动物可能不对PrP-res起血清学反应，通过接种试验动物来诊断需要18个月的工作，所以，迄今为止，瘙痒病和BSE使用组织病理学、临床和流行病学方法进行诊断。临床诊断是于死后对大脑进行组织病理学检查。BSE状态可细分为：BSE阳性、BSE阴性和BSE可疑。被认为BSE可疑的动物显示出与BSE阳性的动物相同的临床症状。但在检查时，BSE的组织病理学表现为阴性。但是这种BSE可疑状态可能是一种“前BSE阳性”状态，尽管在一些病例中采用了另一种诊断方法或者动物也许没患BSE。