[发明专利]植物转化方法

说明书

本发明提供一种以农杆菌介导转化植物尤其是转化单子叶植物的方法。

本发明涉及植物转化，尤其是谷类的转化，具体地说，涉及根癌农杆菌或其它农杆菌(在此都称为“农杆菌”)的用途。至今，只能用直接转化法来生成转基因谷类植物。为此，最普遍认可的是粒子枪轰击法。最近，有报道称，某些谷类可用农杆菌进行基因改造(Hiei等，植物分子生物学(1997)35：205-218)；Ishida等，自然生物技术(1996)14：745-750；Cheng等，植物生理学(1997)115：971-980；Tingay等，植物杂志11：1369-1376(1997))。

文献中报道的转化率对不同的谷类变化很大。典型的如高度依赖于基因型的玉米系统，其转化率很低。对于稻米的转化率据报道也较低，对小麦的转化率尤其低。在以上系统中，都是将农杆菌体外用于正在去分化或已经去分化的分离组织。

如上所述，已经有了对用于稻米(Hiei，1997)，玉米(Ishida，1996)，小麦(Cheng，1997)和大麦(Tingay，1997)的农杆菌转化系统的报道。这些方法的一项共同特征是从供体植株分离获得外植体(以未成熟的胚或胚形成性愈伤组织为佳)，并用农杆菌体外接种。

Hess及其同事(植物科学72：233-244，1990)曾尝试将农杆菌接种到小麦的小穗来转化小麦。其目的是通过花粉的转化来传递基因，然后通过正常授粉获得转化的种子。其中没有或没有提及从接种后的小穗分离出组织然后在培养基中筛选并再生。

另有报道通过苗端接种进行玉米和稻米的农杆菌转化(Gould J(1991)植物生理学95：426-434；Park SH(1996)植物分子生物学32：1135-1158)。同样，其目的仍是通过转化繁殖细胞获得转化的种子。这种再生途径不同于本发明方法：实际上，此类方法的一项特殊目的是避开所有经历组织去分化和偶然性再生的植物再生方法。

美国专利5,177,010和5,187,073(Goldman等)描述了一种转化玉米和禾本科的方法，包括造成新出籽苗创伤，用农杆菌接种。同样，该方法的目的是转化籽苗中的繁殖细胞，从而在天然植株中形成繁殖器官，并由此回收转化的花粉。

另一种方法是试用农杆菌转染法来转化谷类。美国专利5,569,597(Grimsley等)描述了一种用农杆菌将病毒DNA导入植株的方法。将玉米斑纹病毒的DNA插入农杆菌的T-DNA，然后用此携带病毒DNA的农杆菌接种玉米的籽苗，如果出现疾病症状，则表明病毒在植物细胞内繁殖。因此，农杆菌在此作为将病毒DNA引入植物的载体，病毒可由此引起系统性感染。然而，没有证据表明农杆菌转染能获得病毒DNA进入植物基因组的植物转化。该专利的转化仍以分生组织为目标，以获得转化的繁殖细胞为目的。

在本发明的新方法中，靶组织在其天然植株环境中被接种以农杆菌并共培养。如此，靶组织仍可按照正常的生理和时序途径发育。然后，从其正常环境中分离出靶组织，由去分化和再生途径形成转基因植物。所示转基因植物以能育的为佳。

本发明中，“处于其天然植株环境”包括靶组织能够按照基本正常的生理和时序途径发育的所有情形。这些情形包括靶组织处于体内，靶组织仍在植株之内、之上或与之相连(例如，靶组织是半裂分蘖上种子内的胚)，或靶组织仍处于与其在植株上时相同的细胞环境中(例如，靶组织是分离的种子或其部分中的胚)。其它例子包括仍在叶鞘内或至少仍与植株相连的未成熟花序，或仍在未开花蕾中的未成熟花药。

去分化指细胞簇，例如愈伤组织表现出无序生长。

除靶组织处于与其在植株上时相当的环境之外，农杆菌也处于更似其天然环境的环境中。因此，农杆菌转化靶组织的效率很可能高于现有技术在培养皿中所进行的。

以上两因素的结果之一是将所需转基因导入靶组织的转化率更高，因此生成转基因植物的转化率也更高。

大多数转化方法中的基本步骤之一是造成靶组织创伤。就农杆菌而言，这可能出于两个理由：暴露出对转化产生应答并能够再生的细胞，(尤其对禾本植物来说)和诱导农杆菌传递其T-DNA。一种已公开的用于小麦的无创伤方法仍用到一种润湿剂(Silwet或普卢兰尼克酸)或真空抽滤(WO97/48814)。所有以上方法都不可避免地有组织损伤，并因而降低再生能力。

在本发明的优选实施方式中，靶组织内表现的创伤被保持在最低水平，或完全没有一虽然可能用到润湿剂，但这并不是必须的。在传递过程中可能出现组织的潜表损伤，但即使此时，作为农杆菌作用目标的大部分可再生细胞仍是完好的，其再生能力不受影响。