[发明专利]使用解旋酶测定多核苷酸序列

说明书

发明领域

本发明涉及一种测定多核苷酸序列的方法。

发明背景

人们对多核苷酸的序列测定有相当大的兴趣。可在WO-A-99/05315中找到一种有效的序列测定方法的简概及描述。

发明概述

本发明基于测定电磁辐射可用来检测解旋酶和/或者引发酶的构象和/或者质量变化，当解旋酶和/或者引发酶利用NTP水解产生的能量，将双链DNA(dsDNA)解旋为单链DNA(ssDNA)时，这些蛋白质内可发生构象和/或者质量变化。

根据本发明，测定多核苷酸序列的方法包括以下步骤：

(i)在适于解旋酶活性的条件下，将靶多核苷酸与解旋酶/引发酶、NTP源反应(即利用NTP水解产生的能量使DNA解旋)；以及

(ii)通过测定辐射，检测经解旋酶的作用特定碱基或者碱基对的分离和/或者邻近。

使用解旋酶来测定多核苷酸序列为本方法的成功提供了一些有利条件。首先，减少了多核苷酸分子内存在的二级结构问题，因为解旋酶在其天然环境下，遇到并排除这些结构。其次，解旋酶可在室温下，直接测定双链DNA的序列。解旋酶的这种能力提供了可简化靶多核苷酸操作的有利条件，并提供了对长多核苷酸摸板测序的可能性。

通过使用一些技术，可将辐射应用于样本。这些技术包括表面敏感检测技术(其中例如将解旋酶与固相支持物结合)，在固相光学表面上光反应的变化用于指示表面上的结合相互作用。在本发明的一个优选的实施方案中，所用技术为损耗波光谱学，特别是表面胞质共振(surfaceplasmon resonance，SPR)波谱学。

发明描述

在本发明的一个实施方案中，解旋酶获得的以NTP方式提供的能量是在严格控制之下的。就是说：解旋酶沿着被测序之DNA链的移动是通过直接控制其结合位点区解旋酶分子可获得的能源分子的浓度而调节的。这样使得酶活性可调节，以促进对辐射的测定，从而识别解旋酶或者解旋酶复合体邻近区的一个碱基或者碱基对。

另外，由于解旋酶构象的变化可使它进行水解反应和/或沿着多核苷酸移动，可通过控制解旋酶经历构象变化的能力，完成对DNA解旋和测序进展的控制。通过设计(使用当今技术水平的基因操作技术)解旋酶，使该分子含有可使该分子将辐射转变或者转换为构象变化的化学/部分基团，可以实现上述目的。以可确保每一个核苷酸检出的方式对解旋酶活性进行选择性控制。因此本方法是在实时基础上进行的，以获得快速的序列分析。以同样的名称，在同一天提交的共同未决的PCT申请描述了控制的优选方法，其中内容在此处引用作为参考。

本方法测定多核苷酸序列时，涉及到对解旋酶与靶多核苷酸之间构象/动力学相互作用的分析。通过监测如果反应进行时电磁或者其它辐射的改变或吸收来测定构象/动力学的相互作用。

此处用到的术语“多核苷酸”可以广义解释，包括DNA与RNA，还包括经修饰的DNA与RNA，以及其它的杂合核酸样分子，例如肽核酸(PNA)。

此处用到的术语“解旋酶”可以广义解释，它从属于使用或者不使用来自NTP水解的能量将双链多核苷酸解旋为单链多核苷酸的遍在蛋白质(Dean等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)(1992)267：14129-14137；Bramhill等人，细胞(Cell)(1988)54：915-918；Schions等人，细胞(1988)52：385-395)。

二十多年前，发现了第一个解旋酶并对其进行了分类(Abdel-Monem等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)(1976)65：411-449 & 65；431-440)。来自原核、真核和病毒系统的新解旋酶不断被发现，并对其特征进行了描述。所有这些分子体系均在本发明的范围之内。

本发明使用的解旋酶可为任何已知类型的解旋酶。可以是任何DNA依赖的DNA解旋酶，例如大肠杆菌(E.coli)DnaB解旋酶(Xiong等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1996)259：7-14)。如果靶多核苷酸是RNA分子，那么解旋酶可以是RNA依赖的解旋酶或者是可以对两种形式的多核苷酸作用的解旋酶。也可以用消化酶，例如外切酶或者拓扑异构酶。