[发明专利]新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因,以及利用它们生产羧酸的方法

说明书

相关申请的交叉参考

本申请基于35 U.S.C.第111(a)款的规定要求享有在2000年2月22日申请的且序号为60/183，754的美国临时申请的申请日的权利以及按照35U.S.C.第111(e)(i)款的规定，在35 U.S.C.第111(b)款规定的基础上要求享有在2000年2月22日申请的且序号为60/183，821的美国临时申请的申请日的权利。

技术领域

本申请涉及一种新型红球菌属细菌和利用新型红球菌属细菌水解腈化合物的氰基来生产相应羧酸的方法。本申请还涉及一种生产羧酸的方法，特别涉及利用由含有源自于对芳香聚腈化合物的氰基具有特别强的位置选择性的红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因的质粒转化的转化体生产氰基羧酸的方法，还涉及所述转化体，所述质粒，所述基因，利用所述转化体生产酶的方法和通过该方法获得的酶。通过本发明获得的羧酸，特别是氰基羧酸被用作合成药物、农用化学品、染料和其它化学品的起始物。

背景技术

针对水解腈化合物的氰基来获得相应羧酸的反应进行了大量研究，因为这是获得羧酸的简单易行的方法。

关于只水解一个分子具有多个氰基的聚腈化合物的部分氰基来获得相应氰基羧酸的生物反应，特别是，关于通过选择性水解芳香聚腈化合物的一个特定氰基来获得芳香氰基羧酸的方法，已有许多有关利用微生物反应特异性的报道。例如，US4629700公开了一种利用红球菌属细菌由邻苯二甲腈生产氰基苯甲酸的方法。又例如，EP178106公开了一种利用革兰氏阳性菌的四个属其包括红球菌属、通过选择性水解聚腈化合物的氰基来生产氰基羧酸和氰基羧酸酰胺的方法。

为了进行反应，必需一个复杂的过程如特定氰基的保护，所以化学合成中的氰基选择性水解反应通常不适合于实际应用。

生物反应通常被公认为具有高选择性。然而，严格检测后发现，许多情况下，由于副反应的发生伴随有杂质的产生。例如，按照上述利用红球菌由邻苯二甲腈生产氰基苯甲酸的方法，选择性不是100％，而反应伴随有在邻苯二甲腈中产生1.0％至百分之几的副产物。从起始物转化的角度来看，这可以被认为是一个很好的方法。然而，在合成药物或优质化学品时，少量副产品严重地影响了利用含有该副产品的起始物合成的物质的性能或安全性。因此，上述选择性对于这一领域的起始物不够高。

为了检测产物的纯度，可以考虑用一种获得产物并继而进一步纯化它的方法。然而，例如，在由芳香聚腈生产氰基羧酸的生物学方法中产生的各种副产物在物理性质如沸点和疏水性方面彼此非常相近，因而通过一般使用的纯化方法如蒸馏、萃取和盐析不能获得完全的分离。

因此，在利用微生物通过腈化合物的水解反应生产羧酸的常规方法中，水解反应本身的选择性不高并且副产物的产量没有被充分地降低。

通过水解腈化合物生产羧酸的替代方法包括利用腈水解酶或腈水合酶和酰胺酶的酶反应方法。

腈水解酶是一种催化由腈化合物转化为羧酸的反应的酶并且这是用于获得作为医药和农业化学品制剂的原料的羧酸的有效手段。产生这种酶的微生物实例包括茄病镰孢(Fusarium solani)(见，生物化学杂志，167，685-692(1977))，诺卡氏菌属的菌(Nocardia sp.)(见，国际生物化学杂志(Int.J.Biochem.)，17，677-683(1985))，节杆菌属的菌(Arthrobacter sp.)(见，应用环境微生物学，51，302-306(1986))，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)JI(见，欧洲生物学杂志，182，349-356(1989))，玫瑰色红球菌K-22(见，细菌学杂志，172，4807-4815(1990))，玫瑰色红球菌PA-34(见，应用微生物生物技术，37，184-190(1992))和红球菌ATCC39484(见，生物技术应用生物化学，15，283-302 sp.(1992))。

可从这些微生物产生腈水解酶、腈水合酶或酰胺酶。为了在遗传工程中使用这些酶，已分离这些酶中的一些酶基因并且测定它们的一级结构。有关腈水解酶的基因，从红球菌属细菌中的基因，例如，在JP-A-7-99980(本文使用的术语“JP-A”表示未审日本专利申请，首次公开)和JP-A-9-28382中。