[发明专利]鸟类多能胚胎生殖细胞系

权利要求书

1.一种制备已建立的鸟类胚胎生殖(EG)细胞系的方法，包括以下步骤：

(a)在补加细胞生长因子和分化抑制因子的培养基中培养从鸟胚胎生殖腺分离出的原生殖细胞(PGC)，以便获得EG细胞集落；

(b)在与步骤(a)相同的培养基中，应用饲喂层培养EG细胞，直到EG细胞建群；和

(c)提取并在与步骤(a)相同的培养基中传代培养EG细胞，以便建立EG细胞系。

2.权利要求1的方法，其中鸟类胚胎生殖腺处于14至36期。

3.权利要求2的方法，其中鸟类胚胎生殖腺处于24至30期。

4.权利要求1的方法，其中鸟类品种是火鸡、小鸡、鹌鹑、雉或鸭子。

5.权利要求1的方法，其中当在步骤(a)中培养原生殖细胞时，使用一层生殖脊基质细胞(GRSC)作为饲喂层。

6.权利要求1的方法，其中生长因子选自干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白介素-11(IL-11)、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和它们的混合物。

7.权利要求1的方法，其中培养基附加选自0.05-500ng/ml SCF、0.1-1000ng/ml bFGF、0.0004-4ng/ml IL-11、0.1-1000ng/ml IGF-1和它们混合物的生长因子。

8.权利要求1的方法，其中分化抑制因子是白血病抑制因子(LIF)。

9.权利要求8的方法，其中LIF的量为0.1-1000单位/ml。

10.权利要求1的方法，其中培养基进一步含有哺乳动物或鸟类血清。

11.权利要求1的方法，其中培养基进一步含有选自丙酮酸钠、谷氨酰胺、β-巯基乙醇和它们混合物的补加成分。

12.权利要求1的方法，其中饲喂层具有有丝分裂活性。

13.权利要求1或12的方法，其中饲喂层是成纤维细胞或其等同物。

14.权利要求13的方法，其中成纤维细胞是鸟类成纤维细胞或鸟类胚胎成纤维细胞。

15.权利要求14的方法，其中鸟类品种是小鸡。

16.一种按照权利要求1的方法制备的鸟类胚胎生殖(EG)细胞系。

17.权利要求16的鸟类EG细胞系，其可以通过反复继代培养维持。

18.权利要求16的鸟类EG细胞系，其表达SSEA-1抗原、形成胚状体、并分化和形成多种组织。

19.权利要求16的鸟类EG细胞系，其是具有与保藏号为KCLRF-BP-00026的鸡胚生殖细胞系基本上相同特征的鸡胚生殖细胞系。

20.一种制备体细胞或种系嵌合体的方法，包括将权利要求16的鸟类EG细胞注射到卵细胞中。

21.权利要求20的方法，其中将EG细胞注射到生殖腔或卵细胞的血管中。

22.权利要求21的方法，其中将EG细胞注射到X期的卵细胞的生殖腔中。

23.权利要求21的方法，其中将EG细胞注射到13至17期的卵细胞的血管中。

24.一种将外源基因转染到EG细胞或PGC中的方法，特征在于应用电穿孔或脂质体。

25.一种筛选稳定转染的EG细胞或PGC的方法，包括在含抗生素的培养基中传代培养转染了外源基因的EG细胞。