[发明专利]增加转基因生物质的方法

说明书

本发明涉及一种提高转基因生物质的数量和质量的方法，并且将以玉米为例进行更具体地说明。

延缓具有治疗用途的重组蛋白在植物中表达的开发的因素是获得含有所述重组蛋白的植物原材料所需要的时间，这一时间不能够减少。

这一问题在诸如玉米的某些物种中显得尤为突出，因为一方面获得初级转化体所需要的时间比较长，另一方面，进行所述重组蛋白表达的器官(在这里是组织)的产量较小。因此，这种类型植物的使用，在纯化并提取所产生的重组蛋白之前，需要繁殖阶段。这些阶段对于工程动力学来说是有害的。

本发明的目的是增加第一代所获得的生物质，并因此减少为了获得大量的生物质所需要繁殖阶段的数量。这将有可能极显著地缩短研究和开发过程时间，并获得较廉价的、大量的植物原材料或生物质，同样还能缩短分析感兴趣的重组蛋白的一致性所需要的时间。

种子繁殖是一种对数现象：在每一代，所获得的具有典型的可转化基因型的种子的数量大约增殖100倍，这一过程的农艺价值是较低的。根据所采用的杂交技术——回交或者自交，由可变比例的所形成的种子会含有感兴趣的基因。

本申请人业已发现，这一问题的解决方案在一定程度上有赖于增加有性繁殖之前的原始种子库，这样，有可能获得一个繁殖周期，并极迅速的获得另人满意的生物质的数量，用于在上述类型的植物中进行实验和重组蛋白生产。

因此，本发明的一个目的是增加转基因植物生物质的方法，其特征在于它包括以下步骤：

(a)繁殖植物愈伤组织，该愈伤组织含有一个感兴趣的遗传转化事件，并且能够再生；

(b)可选地选择至少含有一个感兴趣的遗传转化事件的愈伤组织；

(c)由所述愈伤组织再生完整的转基因植株，称之为原始转化体或T0植株；

(d)用非转基因花粉给所述原始转化体授粉；

(e)收获所得到的种子，称之为T1，它里面至少整合了一个感兴趣的转基因；

(f)播种所述转基因T1种子，并通过自花授粉或自由授粉形式让所产生的植株授粉；

(g)收获T2种子。

该方法优选预先[有遗漏]还包括另一个对T2种子实施收获后表型分类的步骤。

更优选所述分类是对来自仅被用作母本的植株的T2种子进行的。在本发明的一种优选实施方案中，转基因T2种子具有不同于非转基因种子的有色表型。

特别优选的是，来自被用作父本植物和用作母本植物的植株的T2种子是彼此独立地收获的。

所述植物优选是异花授粉的，所述植物更优选是玉米。

在一种优选实施方案中，所述在用非转基因花粉授粉之前，对所述原始转化体进行割穗或去雄。

在另一种优选实施方案中，所述繁殖步骤包括产生几十个，优选大约20个拷贝的含有每一种遗传转化事件的植株。例如，对玉米来说，为了获得含有一个或多个转基因的玉米愈伤组织，可以使用用农杆菌属转化玉米的技术，涉及到使用未成熟的胚胎。该技术包括一个再生阶段，由此产生能够有效拷贝的转化体。这一拷贝过程比较容易实施，从而有可能体外获得幼小的转化T0植株，这些植株在转基因上是严格相同的。这些植株可用肉眼分离，并且是具有良好的可靠性的原始植株的拷贝。所涉及到的额外的工作相当于克隆工作，在人工气候室中培养所有的克隆，然后在温室中培养，以及通过分子分析有价值的克隆的性质而进行的控制。可以对所有的原始转化体进行所述克隆，然后，再进行一次生化筛选之后，举例来说，仅有最有价值的(有与插入片段一致的最强的表达)转化体被保留下来。

根据另一种优选实施方案，播种转基因T1种子，培养并用作父本植物。

优选地，所述转基因T1种子优选以4/2或6/2的比例与用作母本植物的非转基因植物成行地相间种植。

在这种情况下，更优选的是所述母本转基因植物是雄性不育植物。

根据上述实施方案的一种优选变体，所述母本非转基因植物是去过雄的。

最后，与父本植物相比，所述母本植物优选具有较高的农艺价值。

下面的详细说明通过非限定性实施例的形式说明了本发明的优选

实施方案。

实施例

植物的遗传转化需要整合转基因，筛选转化的细胞，繁殖并分化成新的小植株。

对玉米进行遗传转化的技术，如Y.Ishida等所述(自然生物技术，14卷，1996年6月，745-749)，要么使用粒子枪要么使用农杆菌，包括繁殖具有再生潜力的转化的愈伤组织。本发明的第一部分包括扩大由遗传转化事件所获得的再生的数量。