[发明专利]电化学检测核酸寡聚体杂交事件的方法

说明书

发明领域

本发明涉及修饰的核酸寡聚体以及电化学检测序列特异性核酸寡聚体杂交事件的方法。

发明背景

在疾病诊断、毒理学试验方法、遗传学研究和开发以及农业和制药领域，通常用采用放射自显影或光学检测的凝胶电泳方法来进行DNA和RNA序列分析。

在最重要的采用光学检测的凝胶-电泳方法-Sanger法中，含有DNA的溶液被分成4份样品。为了区分4份样品，将各样品的引物(复制的互补起始序列)用可以在不同波长下发光的荧光染料进行共价修饰。从引物开始，各样品在DNA聚合酶I的催化下进行复制。除了必需碱基A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)的三磷酸脱氧核苷外，各反应混合物还含有足够的这些三磷酸核苷之一的2′，3′-二脱氧类似物作为阻断碱基(每份样品各含一种四种可能的阻断碱基之一)以在所有可能的结合位点终止复制。在将四种样品混合后，可以得到所有长度的具有阻断碱基特异性荧光的复制DNA片段，并且可以根据长度进行凝胶电泳分类并通过荧光光谱进行鉴定。

另一种光学检测方法是基于在寡核苷酸上连接荧光染料例如溴化乙锭。与染料的游离溶液相比，所述染料的荧光在与双链DNA或RNA缔合后会发生剧烈变化，因此可用于检测杂交的DNA或RNA。

在放射标记中，³²P被构建在寡核苷酸的磷酸骨架内，³²P通常被多核苷酸激酶加到5′-羟基末端。然后，优选将标记的DNA在确定的条件下在四种核苷酸类型其中之一处裂解，从而每条链平均裂解一次。因此，对于给定的碱基类型，在反应混合物中存在从³²P-标记延伸至该碱基位置的链(如果该碱基出现了多次，会相应的产生不同长度的链)。然后将四种片段混合物在四条泳道上进行凝胶电泳分离。然后，制备凝胶的放射自显影图，从该图可以直接读出序列。

几年前，开发了另一种基于光学(放射自显影)检测的DNA测序方法，即，通过寡聚体杂交进行测序(参见，例如Drmanac等，《基因组学》(Genomics)4，(1989)，114-128页，或Bains等，理论生物学(Theor.Biol.)135，(1988)，303-307页)。在该方法中，将完整的一套短寡核苷酸或核酸寡聚体(探针寡核苷酸)，例如寡核苷酸八聚体的所有65536种可能的碱基A、T、C和G的组合结合在载体材料上。结合发生在含有65536个试验位点的有序网格内，每个相当大量的定义一个试验位点的寡核苷酸组合，并且各试验位点(寡核苷酸组合)的位置是已知的。在这种杂交基质中，将寡聚体芯片、即需要测定其序列的DNA片段(靶点)用荧光染料(或³²P)标记然后在仅允许一种特定的双链形成的条件下杂交。通过该方法，靶DNA片段仅与那些其互补序列与自身序列的一部分(八聚体)精确对应的核酸寡聚体(在该例子中为八聚体)相结合。因此，通过光学(或放射自显影)检测杂交DNA片段的结合位置测定出片段中所存在的所有核酸寡聚体序列(八聚体序列)。由于相邻核酸寡聚体序列的重叠，DNA片段的连续序列可以用适宜的数学算法进行测定。该方法的优点之一是测序的微型化，从而可以在一次操作中同时获得庞大的数据量。此外，可以免除引物和DNA片段的凝胶电泳分离。在图1中用长度为13个碱基的DNA片段对该原理进行了举例说明。

在DNA/RNA测序中使用放射性标记有许多缺点，例如在处理放射性物质和接触辐射时需要复杂的、合法的安全防护、有限的空间分辨能力(最大为1mm²)，以及只有当放射性片段的辐射作用于X-线胶片足够长的时间(数小时至数天)时才能有高的灵敏度。虽然可以通过另外的硬件和软件来增加空间分辨力，并通过使用β扫描来缩短检测时间，但这两项均需要相当高的附加成本。

常用于标记DNA的某些荧光染料(例如溴化乙锭)是致突变的，与放射自显影一样，需要适当的安全防护。在几乎所有的情况下，使用光学检测均需要使用一种或多种激光系统，因此就需要有经验的人员以及适当的安全防护。实际的荧光检测需要另外的硬件，例如用于放大的光学元件，并且在改变激发波长和检测波长的情况下(例如在Sanger方法中)，还需要对照系统。因此，根据所需的激发波长和所需的检测性能，可能会需要相当高的投资成本。当通过在寡聚体芯片上杂交进行测序时，检测将更为昂贵，因此除了激发系统外，还需要高分辨率的CCD照相机(电耦合器件照相机)来进行荧光斑的二维检测。