[发明专利]类胡萝卜素尤其虾青素的重组生产及其可利用的生物物质

说明书

本发明涉及类胡萝卜素，特别是虾青素的重组生产，及可用于该生产的生物物质。

已知虾青素分布于多种生物体如动物(例如鸟类如火烈鸟和scarletibis，和鱼如虹鳟(rainbow trout)和大麻哈鱼(salmon))、藻和微生物中。并且还认识到同大多数类胡萝卜素一样，虾青素也具有很强的针对活性氧的抗氧化特性，因此虾青素有望作为医药用途来保护活体细胞免受某些疾病如癌症的侵袭。尤其是，因为虾青素能赋予动物以鲜艳的桔红色并能在市场里吸引顾客，所以从工业应用的角度来看，特别是在鱼如大麻哈鱼的养殖业中对作为显色试剂的虾青素的需要与日俱增。

已知Phaffia rhodozyma为专门生产虾青素的产胡萝卜素酵母菌。与另一种产胡罗卜素酵母，红酵母属的种不同，Phaffia rhodozyma能够发酵某些糖如D-葡萄糖。从工业应用的角度来看，这是一个重要的性质。最近的分类学研究发现Phaffia rhodozyma具有有性繁殖并且其有性形态(telemorphic state)被命名为Xanthophyllomyces dendrorhous(W.I.Golubev；酵母11,101-110,1995)。为了从Phaffia rhodozyma中获得虾青素的高产菌株，进行了一些菌株改造的研究，但近十年中，研究只是局限于采用传统的诱变和原生质体融合的方法。近来，Wery等采用Phaffia rhodozyma研制一种宿主载体系统，该载体系统中非复制质粒以多拷贝被组合到Phaffia rhodozyma基因组的核糖体DNA上(Wery等，基因，184,89-97,1997)。并且Verdoes等报道了更多的用来获得Phaffia rhodozyma转化子及其三个产胡萝卜素基因的改造载体，所述三个基因编码能催化3,7-二甲基-2,6-辛二烯焦磷酸生成β-胡萝卜素的酶(国际专利WO97/23633)。基因工程方法对于Phaffia rhodozyma的菌株改造研究的重要作用日益增加，在不久的将来将突破通过传统方法达到的产率。

如上所述，虾青素具有抗氧化剂特性，并且这一特性似乎在体内具有防活性氧类物质如O₂.,H₂O₂和OH.的重要作用，该活性氧类物质在活细胞中不断的产生。经过传统的化学诱变后，通过筛选抗霉素-敏感菌株，An等从Phaffia rhodozyma中获得了虾青素高产菌株(An,G-H.等，应用环境微生物学(Appl.Env.Microbiol.),55(1),116-124,1989)。已知抗霉素是细胞色素b和c₁之间呼吸链的抑制剂(Lucchini,G.等，Mol.Gen.Genet.,177,139-,1979)并能增强这种抗霉素-敏感突变株中的色素形成作用。由于初级呼吸链中bc₁复合物阻断而产生的活性氧类物质促进了类胡萝卜素的生成(An,G-H.等，应用环境微生物学，55,116-124,1989)。实际上，培养基中加入生成O₂的物质杜醌能够增加Phaffia rhodozyma中类胡萝卜素的总含量(主要的类胡萝卜素是虾青素)以及叶黄素的相对含量，而活性氧类物质淬灭因子甘露糖醇则起相反的作用(Schroeder,W.A.等，普通微生物学杂志(J.Gen.Mocrobiol.),139,907-912,1993)。这些结果促使这些作者得出Phaffia rhodozyma中的虾青素具有抗氧化剂特点的结论。事实上，如果充分诱导生物氧化作用，就会增加指数生长后期产生虾青素的量。此外，培养基中加入氧化底物如乙醇能增强Phaffia rhodozyma中虾青素的产生量(Gu,W-L.等，J.Ind.Mocrobiol.Biotechnol.,19,114-117,1997)。尽管Schroeder等试图通过比较亲本菌株与抗霉素-敏感的虾青素高产菌株之间的差异，找到作为Phaffia rhodozyma中天然活性氧类物质淬灭因子的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶活性与虾青素的产率之间的关系，但没有观察到体外活性的直接关系。

本发明提供了活性氧类物质淬灭因子的基因和酶，如SOD和过氧化氢酶，它们是可用于改进类胡萝卜素，特别是虾青素的生产工艺的有效生物物质。本发明涉及线粒体和细胞质的SOD和过氧化氢酶编码基因的克隆和测定。本发明还涉及Phaffia rhodozyma中基因裂解后产生的酶的特性。通过在适当的培养条件下于合适的培养基中培养这种转化体能够证实其裂解对胡萝卜素形成的作用。