[发明专利]一种尿液中核苷的测定方法及在恶性肿瘤诊断仪中的应用

说明书

本发明涉及色谱分析技术，特别提供了一种通过高效毛细管电泳从尿液中测定核苷的方法，用于恶性肿瘤的辅助性诊断仪。

尿中修饰核苷已被作为癌症和艾滋病的潜在诊断标记物进行研究。核糖核酸(RNA)特别是转运核糖核酸(tRNA)中除含有四种正常核苷：腺嘌呤核苷(A)、鸟嘌呤核苷(G)、胞嘧啶核苷(C)、尿嘧啶核苷(U)外，还有大量修饰核苷。现已发现有90多种修饰核苷，其中tRNA中已发现79种，其它来自于mRNA和rRNA中。所有修饰核苷是在大量高度特异性的修饰酶的作用下，尤其是甲基转移酶和连接酶的作用下，RNA链上特定位置的核苷被修饰如碱基甲基化、碳氮键发生重排、尿苷移位形成假尿苷等。转录修饰完成之后，RNA分子在核酸酶作用下释放出各种核苷。血中正常的未被修饰的核苷可以在酶的作用下，被磷酸酯化后再利用形成新的RNA，或降解为尿酸和β-丙胺酸。而修饰核苷十分稳定，既不易代谢也不能被磷酸酯化再利用，因此在尿中被定量排放。所以，在尿中，修饰核苷的含量相对来说比正常核苷的含量会稍高一些。但无论如何，对正常的成年人来说，个体间排放浓度差异较小，分布在一个较窄的范围。当人体的某一部分发生癌变时，核糖核酸周转加快，导致尿液或血液中修饰核苷的含量急剧增加。根据以上的机理，人们可以通过尿液或血液中修饰核苷浓度的增加程度，对癌症的发病进行早期诊断。

分析尿液或血液中的修饰核苷，可以采用高效液相色谱法(HPLC)，同时还有免疫分析法、气相色谱法。

气相色谱法通常能提供很高的分辨率，但受挥发性的限制，即使经过了化学衍生，也无法检测象t⁶A和Q这样的修饰核苷。

目前临床应用的肿瘤标记物分析仪，主要是基于免疫化学的方法，以分析血清中的某些蛋白质类肿瘤标记物来辅助癌症诊断，一次只能分析一种肿瘤标记物，癌症是一个非常复杂的疾病，它由多基因引起，并由多步骤控制，单靠一二种标记物很难做到早期发现、准确检测；另外免疫分析尽管可以在一天内快速分析多个样品，但是核苷与尿的其它成分会发生交叉反应，也减少了定量分析的准确度。

经典的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，可以一次性分析分离体液中的多个核苷和修饰核苷类肿瘤标记物，信息量大大增多，但是分析柱子比较昂贵，需要经常的维护，使用寿命较短，同时由于RP-HPLC的流动相消耗大量的溶剂，有较多的有机废液排出，从而增加了分析的成本。

本发明的目的是提供一种尿液中核苷的测定方法，其可以高分辨率地、高选择性地一次性分析分离尿液的中多个核苷和修饰核苷类肿瘤标记物，从而使核苷类肿瘤标记物辅助癌症诊断仪器的研制成为可能。

本发明提供了一种尿液中核苷的测定方法，采用毛细管电泳技术，首先将带有内标的随机尿样中的核苷预分离富集，其特征在于：

富集后的分析溶液以200～300mmol/L十二烷基磺酸钠SDS、10～75mmol/L十水合四硼酸钠Na₂B₄O₇.10H₂O、10～100mmol/L二水合磷酸二氢钠NaH₂PO₄.2H₂O为缓冲液，pH为6.5-7.2，用未涂层石英毛细管25～75μm.ID为分离通道，在5～15kV电压和210～280nm检测波长下进行毛细管电泳分析，测定随机尿样中核苷的浓度。

由于尿中多达上万种化学物质，核苷的含量很低，其它成分的干扰太多，无法直接对样品进行分析，应采用苯基硼酸亲和色谱法预分离和富集尿中核苷。本发明所述预分离富集的过程是，将混有3-脱吖尿苷(3-Dzu)作内标的10ml尿样先通过苯基硼酸柱，经苯基硼酸柱洗脱的溶液，在旋转真空蒸发器中蒸发至干，再用1mL的Milli-Q超纯水溶解作为分析溶液。相比原尿样中的核苷浓度，萃取后浓缩了十倍。

富集后的核苷用高效毛细管电泳法进行分析。由于在pH 7左右核苷是不带电的物质，应用胶束电动力学毛细管色谱法。为此，使用SDS作表面活性剂，在硼酸盐和磷酸盐缓冲液中对萃取出的尿中核苷进行毛细管电泳分离分析。由于尿液数量受饮食等影响，上述分析最好用24h尿，看一天里病人排放的尿中核苷的总量。但24h尿采集起来又非常不方便。为此，本发明将所述测定的核苷浓度与测定的尿液中肌酐的浓度(creatinine)相除，以获得一不随24小时饮食变化的尿液中核苷的标定参量。所述尿液中肌酐的浓度可以用Jaffe法、毛细管电泳法或高效液相色谱法测定。