[发明专利]新的蛋白基因及内含子

说明书

本发明涉及来自大型多管水母的新的绿色荧光蛋白的基因组DNA序列、cDNA序列及其蛋白，由此cDNA序列突变而来的3个核苷酸序列及其蛋白，新的发光蛋白的基因组DNA序列及其蛋白，来自细小多管水母的新的发光蛋白的基因组DNA序列及其蛋白，其中所述新的绿色荧光蛋白可用作监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记，还可以用于体外蛋白质相互作用研究，新的发光蛋白可用作细胞内Ca²⁺指示剂、细胞内基因表达、发光免疫检测的良好标记，因此本发明的绿色荧光蛋白的基因的DNA序列、cDNA序列及其蛋白可用于疾病诊断及与发光蛋白有关的领域。

发光水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)存在于发光水母体内，在紫外光或蓝光照射下会发出绿色荧光，是近年来出现的一种革命性的标记分子，已被大量应用于由病毒、细菌、真菌、植物、低等动物到哺乳动物等多种生命形式的多个领域的研究中。

1992年Prasher等首先从美国西海岸附近水域的发光水母中克隆出gfp基因的全长cDNA及大部分基因组DNA[(Prasher,D.C.,Eckenrode,V.K.,Ward,W.W.,et al.,Gene,111:229-233(1992))。真正使人们意识到gfp作为标记基因的巨大应用潜力的是1994年Chalfie等人的研究，他们将gfp的编码序列分别转入大肠杆菌E.coli和四膜线虫C.elegans中，均表达出了与天然GFP性质极其相似的重组GFP，表达gfp基因的细胞在紫外光或蓝光照射下发出清晰明亮的绿色荧光[Chalfie,M.,Tu,y.,Euskirchen,G.,et al.,Science263:802-808(1994)]。四膜线虫的mec-7基因编码一种β-微管蛋白，这种蛋白在线虫的6个触觉感受神经细胞中含量丰富。将gfp基因置于mec-7启动子之下，转化新生线虫，转基因线虫成功表达出了GFP，其表达模式与用MEC-7抗体或mec-7-1acZ嵌合表达检测出的模式相似，在活的线虫体内可以清楚地看到6个神经元的细胞体和突起，在幼虫中可以看到生长腔。

在Chalfie等首先异源表达出野生型gfp基因之后不久，美国Tsien研究小组就通过随机突变从表达gfp的大肠杆菌中筛选出了几株荧光强度更强的和/或荧光光谱改变的gfp变异型，随后该研究小组及其他研究小组又通过类似方法筛选出一些理化、生物学性质有所改变的gfp变异型，如荧光强度增强的GFP(EGFP)、光谱变异的GFP、易表达的GFP等[Heim,R.,Prasher,D.C.,and Tsien,R.Y.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:12501-12504(1994),Heim,R.,Cubitt,A.B.,Tsien,R.Y.,Nature,373:663-664(1995)]。Tsien研究小组还在用X-衍射分析了GFP的晶体结构后，预测出将第203位的苏氨酸替换为组氨酸、酪氨酸等极性芳香族氨基酸有可能改变GFP的发射峰，据此进行了定向突变，产生出发射峰移至527nm左右的黄色荧光蛋白(YFP)。这些变异型GFP与野生型GFP都只有几个氨基酸的差别，而且许多位点的变异的效应可以叠加。

所有这些工作大大加速和扩展了GFP在生命科学众多领域内的应用，内容涉及细胞生物学、分子生物学、发育生物学、免疫学、病毒学、微生物学、植物学、微生态学以及生物工程等众多学科和领域。我国学者在近两年也开始应用GFP作为分子标记在昆虫杆状病毒载体系统方面进行了一些工作。

迄今GenBank中登录的野生型gfp基因完整编码序列有4条(GenBank:AEVGFPA M62653,AVGFP1 X83959,AVGFP2 X83960,AEVGFPL29345)都来自美国西海岸附近水域的发光水母Aequorea Victoria。对这4条序列进行核苷酸和氨基酸的比较，发现核苷酸的同源性在96％左右，238个氨基酸中有8个位点存在变异。